Идентификации белков активное применение. Физико-химические свойства белков. Методы очистки и идентификации белков. Разделение белков по молекулярной массе

Заголовок

2
2

Выделение и очистка белков осуществляется поэтапно.

1. Гомогенизация – это тщательное измельчение объектов биохимического исследования до однородного, то есть гомогенного состояния, то есть белки подвергаются тщательной дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной стенки.
При этом используют:
а) ножевые гомогенизаторы типа Уорринга;
б) пестиковые гомогенизаторы Поттера - Эльвегейма;
в) шаровые и валковые мельницы – для более плотных объектов;
г) метод попеременного замораживания и оттаивания, при этом разрыв клеточной стенки происходит под действием кристалликов льда;
д) метод «азотной бомбы» – под высоким давлением клетки насыщаются азотом, затем давление резко сбрасывают, выделяется газообразный азот, который как бы взрывает клетку изнутри;
е) УЗ, различные пресс - методы, переваривание клеточных стенок ферментами. В большинстве случаев при гомогенизации выделяется тепло, при этом многие белки могут инактивироваться, поэтому все процедуры проводятся в холодных помещениях при t 0 или охлаждают сырье с помощью льда. При этом тщательно контролируют объем и время разрушения клеток, рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенизат, который может подвергнуться дальнейшему экстрагированию.

2. Экстракция белков , то есть их перевод в растворенное состояние; чаще всего экстракцию проводят вместе с измельчением одновременно.

Экстракцию проводят:
а) растворением в 8-10% растворах солей;
б) с использованием буферных растворов с рН от кислых до слабощелочных (боратных, фосфатных, цитратных, трис - буферных: смесь трисаминометана с NH2 – CH3 + HCl;
в) осаждение белков органическими растворителями (этанол, метанол, бутанол, ацетон и их комбинациями), при этом происходит расщепление белково-липидных и белково-белковых компонентов, то есть разрушение ЧСБ.

3. Очистка и фракционирование белков. После экстрагирования производят разделение или фракционирование смеси на индивидуальные белки и их дальнейшую очистку:

а) высаливание – это процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами щелочных и щелочноземельных металлов.

Механизм высаливания – добавляемые анионы и катионы разрушают гидратную белковую оболочку белков, являющуюся одним из факторов устойчивости белковых растворов. Чаще всего применяются растворы сульфатов Na и аммония. Многие белки отличаются по размеру гидратной оболочки и величине заряда. Для каждого белка есть своя зона высаливания. После удаления высаливающего агента белок сохраняет свою биологическую активность и физико-химические свойства. В клинической практике применяется метод высаливания для разделения глобулинов (при добавлении 50% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок) и альбуминов (при добавлении 100% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок).

На величину высаливания оказывают влияние:
1) природа и концентрация соли;
2) рН-среды;
3) температура.

Главную роль при этом играют валентности ионов. Поэтому действие соли оценивают по ионной силе раствора μ:

, то есть ионная сила раствора (μ) равна произведению ½ концентрации каждого иона (С) на квадрат его валентности (V).

Метод Кона является разновидностью высаливания. Одновременно происходит экстракция и осаждения компонентов. Изменяя последовательно температуру (обычно низкие t o –0+8 o С), рН раствора и концентрированного этанола, из плазмы крови последовательно выделяют до 18 фракций белков.

Метод Кона применяют в фармацевтическом производстве при получении кровезаменителей;
б) методы хроматографии . Основоположником разработки хроматографических методов анализа считается русский ученый Михаил Цвет (1903). В настоящее время существует много ее разновидностей. В основе метода лежит способность веществ специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонку или помещенном на каком-либо носителе. При этом происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают соответствующие элюенты (растворители), которые ослабляют силы адсорбции и вымывают адсорбированные вещества из колонки. Вещества собираются в коллекторе фракций.

Основополагающим в хроматографии является коэффициент распределения , который равен отношению концентрации вещества в подвижной фазе к концентрации вещества в неподвижной фазе (или стационарной фазе ).

Неподвижная стационарная фаза – может быть твердой или жидкой или смесью твердой и жидкой.

Подвижная фаза – жидкая или газообразная, она течет по стационарной, или пропускается через нее.

В зависимости от вида стационарной и подвижной фазы бывают различные модификации хроматографического анализа.

Адсорбционная – основана на различной степени адсорбции белков адсорбентом и растворимости их в соответствующем растворителе.

Применяемые адсорбенты – кремниевая кислота, Al 2 О 3 , CaCO 3 , MgO, древесный уголь. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще с буферным раствором) упаковывают в колонке (стеклянная вертикальная трубка). Образец наносят на колонку, затем через нее пропускают растворитель или смесь растворителей.

Разделение основано на том, что вещества с более высоким К распр. (Б), продвигаются по колонке с большей скоростью. Сбор фракций осуществляется с помощью коллектора фракций.

Распределительная хроматография – основана на распределении смеси белков между двумя жидкими фазами. Разделение может происходить на специальной хроматографической бумаге, а также в колонках, как в адсорбционной. Твердая фаза в данном случае служит только опорой для жидкой стационарной фазы. Хроматографическая бумага обладает свойством задерживать воду между своими целлюлозными волокнами. Эта вода - неподвижная стационарная фаза. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вместе с растворителем.
В случае распределения хроматографии на колонке – носители – это целлюлоза, крахмал, силикагель и др., неподвижная фаза – вода. При нанесении на колонку вещества смеси движутся по колонке с разной скоростью с учетом Краспр.

Rf для каждого соединения в стандартных условиях величина постоянная.
Ионообменная хроматография – основана на притяжении противоположно заряженных частиц. Для этого используют различные ионообменные смолы: катионообменные – содержат отрицательно заряженные группы – сульфированные стиролы и КМЦ, которые притягивают положительно заряженные ионы исследуемых веществ. Их называют также кислотными ионообменниками.
Анионообменные смолы, или основные ионообменники, содержат положительно заряженные группы, притягивающие отрицательно заряженные молекулы белков
Триметиламиностирол, это производное стиролов и целлюлозы.
В зависимости от q разделяемых белков используют соответствующие ионообменники, с которыми взаимодействуют определенные белки, а другие беспрепятственно выходят из колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают, используя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.
Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) основана на принципе избирательного взаимодействия белков или других макромолекул с иммобилизованными на носителях специфическими веществами – лигандами (это может быть кофермент, если выделяют фермент, антитело антиген и др. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованным лигандам к нему присоединяется только один белок из смеси. Смывается буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой.
Достоинство – возможность одноэтапно выделить заданное вещество высокой степени чистоты.
Метод гель - фильтрации или метод молекулярных «сит» - это разновидность проникающей хроматографии.
Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которые обладают многие пористые материалы, например органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Гель фильтрация – это разделение веществ с помощью гелей, основанное на различиях в размере молекул (сефароза, сефадекс, сефакрил, биогели и т.д.). Под действием эпихлоргидрина полисахаридные цепочки декстрана (синтезируется микроорганизмами) сшиваются в сетчатую структуру, становятся нерастворимыми в воде, но сохраняют к ней большое сродство. Благодаря этой гидрофильности полученные зерна (называемые сефадексом) сильно набухают с образованием геля, которым заполняют колонку. Метод основан на том, что крупные молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу, а более мелкие молекулы сперва проникают в поры «сита», как бы застревают в них, а поэтому движутся с меньшей скоростью. Соответственно белки с большей Mr первыми поступают в приемник. В последнее время в проникающей хроматографии все чаще используют в качестве молекулярного сита пористые стеклянные гранулы.
Электрофоретический метод в биохимии – основан на различии скорости передвижения молекул в электрическом поле (аминокислоты, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты).
Различие скорости движения зависит:
1. от q молекулы: подвижность молекул тем больше, чем больше суммарный q. Величина q зависит от рН;
2. от размеров молекул: чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность. Это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой;
3. от формы молекул: молекулы одинакового размера, но различной формы, например, фибрилл и глобул белка обладают различной скоростью. Это связано с различиями в силах трения и электростатического взаимодействия.
Виды электрофореза
а) Изоэлектрическое фокусирование. Разделение происходит на вертикальной колонке в град. как рН, так и напряжения. С помощью специальных носителей амфолитов в колонке устанавливается град. рН от 0 до 14. В колонку помещают смесь веществ, подключаю электроток. Каждый из компонентов движется к той части колонки, где значение рН соответствует его изоэлектрической точке и там останавливается, то есть фокусируется.
Достоинство: происходит разделение, очистка и идентификация белков в один прием. У метода высокая разрешительная способность (0,02 pI).
б) Изотахофорез – это электрофорез на поддерживающих средах. После включения электротока ионы с самой высокой подвижностью движутся к соответствующему электроду первыми, с самой низкой – последними, обладающие промежуточной подвижностью – располагаются посередине.
в) Диск-электрофорез – прибор состоит из двух сосудов с буфером – верхнего и нижнего, соединенных вертикальными трубками, содержащими разнопористый гель. По мере движения ионизированных частиц под действием электротока. Более высокая пористость – в верхней части геля.
г) Иммуноэлектрофорез – метод сочетающий электрофорез с иммунодиффузией (для обнаружения антигенов в сложных физиологических смесях). На специальный носитель перпендикулярно друг другу помещают смесь антигенов и смесь антител. При включении электротока они разделяются на индивидуальные вещества и диффундируют на гелевом носителе. В месте встречи антигена с соответствующим антителом происходит специфическая реакция преципитации в форме дуги. Количеств образовавшихся дуг соответствует количеству антигенов.

Методы определения Mr белков

У большого числа белков химический состав и последовательность аминокислот не установлена (1010–1012 белков), поэтому у таких белков определяют Mr. При этом используются различные методы.
а) Седиментационный метод – определение Mr проводят в специальных центрифугах (первая центрифуга была предложена шведским биохимиком Сведбергом), в которых удается создать центробежное ускорение, которое больше в 200 тыс. и более раз ускорения земного притяжения. Mr определяют по V седиментации молекул. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница белок-растворитель. Скорость седиментации выражают через константу седиментации (S):

где V – скорость перемещения границы белок-растворитель (см/с);
 – угловая скорость ротора (рад/с);
 – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белков (см).
Величина константы седиментации S, которая равна 110–13 С условно принята за 1 и называется 1 Сведбергом (S). S для белков лежит в пределах 1-50 S, иногда до 100 S.
Mr белков определяется по уравнению Сведберга:

где R – универсальная газовая постоянная;
Т – абсолютная температура по Кельвину;
S – константа седиментации;
Д – коэффициент диффузии;
 – плотность растворителя;
V – парциальный удельный объем газа.
Этот метод дорогостоящий из-за применения аппаратуры.
Более просты и дешевы:
б) Гель-фильтрация в тонком слое сефадекса.
Длина пробега белка (в мм) находится в логарифмической зависимости от Mr.
Х – Mr искомого белка на калибровочном графике.
в) Диск-электрофорез в полиакриламидном слое – также существует зависимость между логарифмом Mr калибровочных белков и длиной их пробега.

Методы определения гомогенности белков

Степень чистоты выделенного белка определяется:

• ультрацентрифугированием;
• методом диск - электрофореза;
• различными иммунохимическими методами;
• определением растворимости белка (метод Нортропа) основан на правиле фаз, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от концентрации вещества в твердой фазе.

Если белок гомогенный, то на графике получается один перегиб (а), если есть примеси белков (б, в), то получим несколько перегибов кривой насыщения. У всех белков свои индивидуальные кривые растворимости.

Для идентификации белков используются различные системы поиска в базах данных EMBL, Sequest, разработанные внутри исследовательских коллективов. Однако стандартом для идентификации белков стала поисковая машина Mascot. Как практически во всех поисковых системах в ней используется вэб-интнерфейс и сама поисковая система доступна в Интернете, но ее также можно приобрести и установить на компьютере пользователя.

Mascot может работать с различными подключаемыми белковыми и геномными базами данных. Это могут быть обширные общедоступные базы, такие как NCBI или SwissProt, коммерческие, а также созданные самим пользователем.

Во всех системах идентификация осуществляется по полученным исследователем масс-спектрометрическим данным, путем их сопоставления с известными структурами белков.

Учитывая, что в последние десятилетия сиквенирование белков свелось, по сути, с сиквенированию кодирующих их генов, на практике разумнее идентифицировать белки сопоставляя экспериментальные масс-спектрометрические данные с известными геномами.

Существуют различные алгоритмы идентификации белков, однако их возможности ограничены известными на сегодняшний день геномами. Хотя, учитывая что организмы разных видов все-таки имют гомологичные белки, зачастую удается идентифицировать белки из организмов с неизвестным геномом.

Различные методические подходы протеомных исследований, дают принципиально различные типы данных, и требуют своих вычислительных подходов при обработке.

Наиболее доступным и высокопроизводительном является метод идентификации по масс-спетрометрическим пептидным картам специфического протеолитического гидролиза. В англоязычной литературе он известен как Peptide Mass Fingerprint (PMF) В качестве специфической протеазы чаще всего используется трипсин. На первом этапе выделенный (например, элетрофорезом) белок подвергается протеолитическому гидролизу. В результате такого гидролиза получается смесь пептидов. Учитывая, что используется высокоспецифичная протеаза, это будет смесь вполне определенных пептидов. Так, при использовании трипсина белок будет "порезан" по аргинину и лизину.

Следующий этап - регистрация масс-спектра полученной смеси. В результате чего получается набор или список молекулярных масс. Он не дает никакой информации о структуре или других свойствах продуктов, в основе метода только предположение что это молекулярные массы пептидов, и эти пептиды образовались в результате специфического гидролиза. Здесь и спрятана главная идея подхода - если каждый белок имеет свой набор пептидов и соответствующий ему перечень молекулярных масс, то вполне возможно и решение обратной задачи - найти для полученного перечня молекулярных масс соответствующий ему белок. И такую задачу действительно часто удается решить.

В частности это позволяет сделать маскот.

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются: высокая вязкость растворов,незначительная диффузия, способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давление, способность к поглощению Уф-лучей при 280 нм (это последнее свойство, обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, используется для количественного определения белков).

Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных NH2-и СООН-групп и характеризуются соответственно всеми св-вами кислот и оснований.

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Их растворы обладают очень низким осмотическим давлением, высокой вязкостью и незначительной способностью к диффузии. Белки способны к набуханию в очень больших пределах.

С коллоидным состоянием белков связан рад характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект используется, кроме того, в современных методах, микроскопии биологических объектов. Молекулы белка не способны проходить через, полупроницаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических поражениях, например почек, капсула почечного клубочка (Шумлянского -Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови, и они появляются в моче.

Денатурация белка под влиянием различных физических и химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя нативные свойства. Таким образом, под денатурацией следует понимать нарушение общего плана - уникальной структуры нативной молекулы белка, приводящее к потере характерных для нее свойств (рас-творимости, злектрофоретической подвижности, биологической активности и т. д.). Большинство белков денатурируют при нагревании их раствором выше 50-60о С. Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых растворов, увеличению количества свободных функциональных SH-rpyпп и изменению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря белком его биологической активности (каталитической антигенной или гормональной) При денатурации разрушаются в основном нековалентные (в частности, водородные) связи и дисульфидные мостики и не затрагиваются пептидные связи самого остова полипептидной цепи При этом развертываются глобулы нативных белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры.

высокой способностью хранения, гарантирующей их активное биологическое начало.

ЛИТЕРАТУРА

1. Клычкова Г.Ю. Разработка технологии комплексного препарата из хрящевой ткани кальмара, лосося и осетра // Материа -лы Всерос. Интернет-конф. молодых ученых. - Владивосток: ТИН -РО-Центр, 2004. - С. 164-170.

2. Мецлер Д. Биохимия. Т. 2. - М., 1980. - 605 с.

3. Суховерхова Г.Ю. Биохимическая характеристика хрящевой ткани гидробионтов и технология БАД к пище: Дис. ... канд. техн. наук. - Владивосток, 2006. - 157 с.

4. Сытова М.В. Научное обоснование комплексной переработки амурских осетровых рыб: Автореф. дис. ... канд. техн. наук

М.: ВНИРО, 2005. - 24 с.

Кафедра пищевой биотехнологии

Поступила 07.02.07 г.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ КЕРА ТИНОВОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА

Ч.Ю. ШАМХАНОВ, Л.В. АНТИПОВА

Грозненский государственный нефтяной институт Воронежская государственная технологическая академия

Одним из наиболее эффективных способов обработки вторичных ресурсов мясной и птицеперерабатывающей промышленности является применение методов современной биотехнологии для получения пищевых гидролизатов . Функционально-технологические свойства полученных продуктов зависят от биохимического состава и молекулярной массы его белковых компонентов.

При использовании физико-химических методов для определения молекулярной массы белков результат зависит не только от массы, но и от электрического заряда и формы молекулы белка, особенно при изменении скорости диффузии белка, скорости седиментации в гравитационном поле . В связи с этим при определении молекулярных масс белков предпочтительнее использовать статистические методы, когда белковый раствор находится в состоянии равновесия, например, при пропускании его через колонку, заполненную гелем .

Цель работы - определение молекулярной массы М белковых компонентов кератинового ферментативного гидролизата и его биохимического состава.

Для определения молекулярной массы белковых компонентов кератинового гидролизата применяли метод гель-фильтрации . Использовали сефадекс в-100 (средний, диаметр частиц 40-120 мкм) с пределами фракционирования 4000-150000 Да.

Колонку размерами 46,0 х 1,9 см заполняли сефа-дексом, обработанным 0,02 М универсальным буфером с рН 7,0. Наносили на нее 1,5 см3 раствора -7 мг/см3 - кератинового гидролизата и элюировали тем же универсальным буфером со скоростью 12 см3/ч. Собирали фракции по 3 см3 и затем определяли в них содержание белка спектрофотометрически на СФ-46 при 280 нм. Для определения молекулярной массы фракций кератинового гидролизата колонку с сефадексом предварительно проградуировали в тех же условиях при помощи нескольких чистых (маркерных) белков с известной М. Калибровочную кривую строили, используя линейную зависимость между ^ М и объемом

элюата Уе, вышедшего с колонки. В табл. 1 представлены некоторые физико-химические характеристики маркерных белков.

Таблица 1

Маркерный белок М, Да 1§ м V, см3

Лизоцим 13930 4,143 54

Трипсин 25700 4,409 48

Пероксидаза 34000 4,531 45

Бычий альбумин 68000 4,832 36

Голубой декстран 2000000 6,301 21

Водорастворимая фракция

керопептида <10000 2,845 72

Водорастворимая фракция кератинового гидролизата выходит с колонки в значительно меньшем объеме, чем маркерный белок лизоцим с наименьшей молекулярной массой. Следовательно, в кератиновом гидролизате (керопептиде) отсутствуют белковые фракции с М > 13930 Да. Ориентировочная масса продуктов гидролиза находится ниже уровня 10000 Да, определяемого методом гель-фильтрации на сефадексе в-100 маркерными белками. Линейная зависимость между ^ М белков и объемом элюата Уе, вышедшего с колонки, представлена на рис. 1 (1 - голубой декстран; 2 - бычий альбумин; 3 - пероксидаза; 4 - трипсин; 5 -лизоцим; 6 - водорастворимая фракция керопептида).

В связи с отсутствием маркерных белков в исследуемом диапазоне 10000-5000 Да поиск фракции водорастворимого белка осуществляли при помощи порис-

Таблица 2

М, Да Растворимый белок и пептиды, мг/см3 Суммарные пептиды и аминокислоты, мкг/см3 Тирозин, мкмоль/см3 Редуцирующие вещества, мкг/см3

0-10000 5,64 7337 7,835 2815

0-5000 4,21 5278 5,960 2272

% от исходной 74,6 71,9 76,1 80,7

тых мембран марок УПМ-100 и УАМ-50 на лабораторной ультрафильтрационной установке (ЗАО НПО «Техкон»). Схема включала саму установку с 5%-м раствором керопептида, помещенную для его постоянного перемешивания на магнитную мешалку. Для эффективного разделения белкового раствора в верхнюю часть установки под давлением подавали сжатый воздух Продукты гидролиза проходили через пористые мембраны, поочередно сменяемые в зависимости от желаемой молекулярной массы ультрафильтрата, в нижнюю часть установки и собирались в приемную емкость. В полученных ультрафильтратах определяли ряд биохимических показателей, позволяющих оценить распределение продуктов гидролиза по молекулярной массе (табл. 2).

В керопептиде присутствуют низкомолекулярные белки с М 5000-10000 Да. Их массовая доля оценивается как разница в показаниях для фракций 0-10000 и 0-5000 Да и составляет 1,43 мг/см3. Эта фракция дала также положительную реакцию на нингидриновую реакцию (2059 мкг/см3), тирозин (1,875 мкмоль/см3) и редуцирующие вещества (543 мкг/см3). Однако основная доля продуктов гидролиза сосредоточена в более низкомолекулярной фракции с М < 5000 Да, соответствующей по существующей классификации фракции пептидов. Массовая доля всех исследуемых показателей составляет более 7 0% от аналогичных значений во фракции 0-10000 Да.

Дальнейшее определение молекулярной массы водорастворимых белковых фракций керопептида проводили на сефадексе в-25 (средний, диаметр частиц 50-150 мкм), позволяющем устанавливать ее в пределах фракционирования 1000-5000 Да. Условия проведения гель-фильтрации оставались неизменными. По

результатам определения белка во фракциях строили профиль элюции. Во всех фракциях помимо белка определяли содержание низкомолекулярных веществ нингидриновым методом, тирозина и редуцирующих веществ (РВ), а также устанавливали количественное распределение белковых фракций. На рис. 2 представлена гель-хроматограмма ферментативного кератино-вого гидролизата через сефадекс в-25 (кривая 1 - белок; 2 - нингидриновая проба; 3 - тирозин; 4 - РВ).

В этом случае белок обнаруживается в виде двух небольших пиков практически в первых же фракциях. Массовая доля белка во фракциях № 1-8 с 3-24 см3

имеет достаточно высокие значения и составляет 0,12-0,18 мг/см3 (кривая 1).

Основная масса продукта выходила с колонки в виде максимального пика белка объемом 27 см3 элюата (фракция № 9, по 3 см3 элюата). Массовая доля белка в этой фракции зарегистрирована на уровне 0,66 мг/см3, что в 3-4 раза выше, чем в остальных исследуемых фракциях.

Дальнейшая элюция керопептида в диапазоне объемов 36-96 см3 выявила три пика с понижением в них массовой доли белка не более 0,08 мг/см3. Полностью раствор керопептида элюируется в конечном объеме 96 см3.

Во фракции № 9 обнаружено все количество имеющихся в наличии РВ массовой долей 66 мкг/см3 (кривая 4). Нингидриновую реакцию применяли при гель-хроматографии для идентификации распределения продуктов гидролиза по молекулярной массе. Установлено, что при взаимодействии избыточного количества нингидрина и белковых продуктов со свободной МН2-группой и в зависимости от количества этих групп можно определить местонахождение белковых

РВ, мкг/см3 175 со Г 5 о л с; ,7 0,

100 125 X - 3 со о о. 0,5

80 § 100 2 _ н 0,4

60 1 изин, 7 сл 0,3

40 1 л 5 о - (П 2 о I- 0,2

20 25 _ 2 ай О 0,1

6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 V, см

производных при элюции через сефадекс. Так, низкая массовая доля нингидрина (4-6 мкг/см3) весьма точно отражает количество свободных аминогрупп и определяет нахождение высокомолекулярных пептидов с М 3000-5000 Да во фракциях J№ 1-8 (кривая 2). Известно, что в диапазон измерения молекулярной массы продуктов гидролиза < 5000 Да входят только пептиды и аминокислоты. При больших концентрациях белка (фракция № 9) соответственно увеличивается окрашивание его свободных аминогрупп нингидрином -64 мкг/см3. Этот диапазон элюции характеризует наличие во фракциях № 8-12 среднемолекулярных пептидов с М 300-3000 Да. Определяемый с помощью маркерных белков по калибровочной кривой lg M керопептида 2,845 также указывает на его ориентировочную массу > 700 Да. Дальнейший анализ профиля элю-ции по нингидриновой пробе (фракции № 12-36) выявил пик, не соответствующий его концентрации по белку, как наблюдалось для пептидов в предыдущих фракциях. Массовая доля низкомолекулярных веществ во фракции № 23 составила 157 мкг/см3, что более чем в 2 раза превышает аналогичный показатель для пептидов во фракции № 9. Обратная пропорциональная зависимость показателей белка и нингидрино-вой пробы во фракциях № 9 и 23 указывает по качественному анализу на присутствие в последней фракции продуктов гидролиза в виде свободных аминокислот. Принадлежность к ней и аминокислоты тирозина (0,06 мкмоль/см3) является еще одним доказательством высказанного положения.

Таким образом, гель-фильтрация кератинового гидролизата через сефадексы G-100 и G-25 свидетельствует о наличии в нем низкомолекулярного раствори-

мого белка (< 10000 Да), составляющего 25% от его общего количества в гидролизате. Преобладающая часть белковых продуктов - 75% - представлена среднемолекулярными пептидами (300-3000 Да) с ориентировочной М > 700 Да. В данном случае белковые цепочки содержат 5-20 аминокислотных остатков. Важно подчеркнуть, что фракция № 9 одновременно дает реакции на биуретовую связь, нингидрин, тирозин и РВ. Подобная характеристика предполагает наличие в белке кератине углеводов и их непосредственной связи с белком в составе единого комплекса.

ЛИТЕРАТУРА

1. Антипова Л.В., Пащенко Л.П., Шамханов Ч.Ю., Ку -рилова Е.С. Получение и характеристика пищевого кератинового гидролизата // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2003. - № 7.

2. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С., По -жалова Н.А. Биохимические характеристики процесса ферментативного гидролиза кератинсодержащего сырья птицеперерабаты -вающей отрасли // Изв. вузов. Пищевая технология. - 2003. - № 5-6.

3. Антипова Л.В., Шамханов Ч.Ю., Осминин О.С. Со -

вершенствование технологии производства керопептида из перо-пу -хового сырья // Мясная индустрия. - 2004. - № 3. - С. 44-47.

4. Рогов И.А., Антипова Л.В., Дунченко Н.И., Жереб -цов Н.А. Химия пищи. В 2 кн. Кн. 1. Белки: структура, функции, роль в питании. - М.: Колос, 2000. - 384 с.

5. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - 536 с.

6. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимоло-гии. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : Высш. шк., 1980. - 272 с.

Кафедра технологии продуктов питания Кафедра технологии мяса и мясных продуктов

Поступила 0S.02.0? г.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕХАНИЗМА КОНСЕРВИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ КОМПОНЕНТОВ КОПТИЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ

С.В. ЗОЛОТОКОПОВА, И.А. ПАЛАГИНА

Астраханский государственный технический университет Астраханский филиал Саратовского государственного социально-экономического университета

Важным направлением исследований последних лет является изучение влияния различных пищевых добавок не только на вкус и аромат, но и на увеличение сроков хранения продуктов питания. С древних времен для консервирования используют пряные растения, поваренную соль, копчение и др. Анализ показывает, что в настоящее время рынок завоевывают коптильные экстракты. Продукты питания с ароматом копчения пользуются у населения особой популярностью, а традиционное копчение уступает свои позиции бездымному.

Экологически выгодными и перспективными являются экстракты, получаемые при щадящих условиях.

Над усовершенствованием технологии экстракции не одно десятилетие работает Г.И. Касьянов - заслуженный деятель науки и техники РФ, заслуженный изобретатель РФ, доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой технологии мясных и рыбных продуктов Кубанского государственного технологического университета. Действующая при КубГТУ и Краснодарском научно-исследовательском институте хранения и переработки сельскохозяйственной продукции под его руководством научно-педагогическая школа «Теория и практика обработки сырья растительного и животного происхождения сжиженными и сжатыми газами» занимается проблемами повышения эффективности переработки различного сырья, позволяющими улучшить качество выпускаемой продукции, сократить продолжительность процессов обработки и одновременно снизить энергетические затраты.

Книга представляет собой первое учебное пособие на русском языке по основам масс-спектрометрии белков и пептидов. Цель настоящего издания - заинтересовать молодых исследователей информативной, красивой и востребованной во всем мире дисциплиной, дать возможность более эффективно применять масс-спектрометрию для решения фундаментальных и прикладных научных задач. Книга написана в формате лекций для начинающих, хорошо иллюстрирована и сопровождается представительным списком цитированной литературы.

Издание рассчитано на студентов и аспирантов химических, физико-химических, биологических и медицинских специальностей; будет полезно научным сотрудникам, уже работающим в области исследований белков и пептидов или интересующимся этим научным направлением.

		7
Использованные сокращения		9
Введение		11
Глава 1. Методы ионизации молекул пептидов и белков		14
1.1. Бомбардировка быстрыми атомами, БВА (Fast Atom Bombardment, FAB)		14
1.2. Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, МАЛДИ (Martix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) 16
1.3. Ионизация электрораспылением, ИЭР (Electrospray Ionization, ESI)		19
Глава 2. Измерение молекулярной массы пептидов и белков		25
Глава 3. Установление первичной структуры пептидов		34
3.1. Деградация по Эдману		34
3.2. Идентификация пептидов по сиквенсу кДНК		36
3.3. Леддерное секвенирование		37
Глава 4. Масс-спектрометрическое секвенирование		39
4.1. Номенклатура фрагментных ионов пептидов		39
4.2. Масс-спектры отрицательных ионов		45
4.3. Методы инициирования фрагментации молекулярных ионов 46
4.3.1. Диссоциация, активированная соударениями, ДАС (Collisionally Activated Dissociation, CAD)		47
4.3.2. Диссоциация индуцированная столкновениямис поверхностью, ДИП (Surface Induced Dissociation (SID)		56
4.3.3. Диссоциация при захвате электрона, ДЗЭ(Electron Capture Dissociation, ECD)		59
4.3.4. Диссоциация при переносе электрона, ДПЭ(Electron Transfer Dissociation, ETD)		64
4.3.5. Фотоактивация диссоциации		65
4.3.6. Диссоциация, активированная электронами		69
4.3.7. Диссоциация отрицательных ионов при отрывеэлектрона		70
4.4. Методы секвенирования пептидов на приборах с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией		71
4.4.1. Метод задержанной экстракции. Распад в источнике, РВИ (In Source Decay, ISD)		71
4.4.2. Распад за пределами источника, РПИ (Post Source Decay, PSD)		72
Глава 5. Идентификация белков и пептидов		7 6
5.1. Идентификация с использованием баз данных		76
5.1.1. Метод идентификации белков "снизу вверх"("Bottom-up")		76
5.1.2. Метод идентификации белков "сверху вниз"("Top-down")		91
5.2. Ручная идентификация пептидов		94
Глава 6. Основные сложности масс-спектрометрическогосеквенирования пептидов и пути их преодоления		97
6.1. Покрытие сиквенса		98
6.2. Аминокислоты с одинаковой целочисленной массой		102
6.2.1. Лизин и глутамин		102
6.2.2. Фенилаланин и окисленный метионин		104
6.3. Изомерные аминокислоты: лейцин и изолейцин		106
6.4. Циклизация коротких пептидов		108
6.5. Пептиды, содержащие дисульфидную связь		116
Глава 7. Использование для секвенирования масс-спектровотрицательных ионов		121
Глава 8. Количественный анализ белков с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографиимасс-спектрометрии. Количественная протеомика		126
8.1. Сравнительная (количественная) протеомика		129
8.1.1. Безизотопный метод		129
8.1.2. Изотопные методы		132
8.2. Установление абсолютных количеств		145
Список литературы		149
Приложение. Bruker: Многомерный путь к разгадке протеома		163

Предисловие

Посвящается
профессорам химического факультета
МГУ им. М.В. Ломоносова
Александру Леонидовичу Курцу
Киму Петровичу Бутину

Важнейшие достижения масс-спектрометрии за последние 20 лет связаны с исследованиями природных соединений, включая биополимеры. С появлением методов ионизации электрораспылением и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации для масс-спектрометрии стали доступны сахара, нуклеиновые кислоты, белки, липиды и прочие биоорганические макромолекулы. Безусловно, наибольших успехов удалось достичь в исследовании белков. Благодаря чувствительности, информативности, экспрессности, возможности работать со смесями, масс-спектрометрия сегодня - основной метод анализа этих сложных для изучения объектов.

Пожалуй, можно признать, что современная масс-спектрометрия выиграла конкурентную борьбу с классическим методом установления первичной последовательности аминокислот в пептидах по Эдману, поскольку масс-спектрометрическое секвенирование оказалась существенно быстрее, чувствительнее, информативнее и даже дешевле. Быстрое и надежное определение первичной структуры белков, т.е. последовательности аминокислотных звеньев, само по себе уже превосходный результат. Однако масс-спектрометрия способна изучать структуры более сложных порядков (от 2 до 4), включая нековалентные взаимодействия белков с появлением надбелковых образований, устанавливать тип и место посттрансляционных модификаций, работать с гликопротеинами, липопротеинами, фосфопротеинами и т.д. Масс-спектрометрия стала незаменимой в медицине, поскольку способна быстро и надежно диагностировать сердечно-сосудистые, генетические и онкологические заболевания. Именно успехи масс-спектрометрии привели к формированию в конце прошлого века нового научного направления - протеомики. Огромна роль метода и в метаболомике.

К сожалению, в русскоязычной литературе до сих пор не существовало учебных пособий или монографий по этой важнейшей и многогранной по своему применению тематике. Россия кардинально отстает от развитых стран и по изучению этой дисциплины, и по использованию ее достижений. Масс-спектрометристам, работающим в России, приходится ориентироваться на англоязычные издания книг, оригинальные статьи и обзоры. В 2012 г. на русском языке была издана книга "Принципы масс-спектрометрии в приложении к биомолекулам" под редакцией Дж. Ласкин и X. Лифшиц (перевод с английского, изд-во "Техносфера"), представляющая собой сборник статей ведущих специалистов в области масс-спектрометрии в приложении к биологии. Книга рассчитана на подготовленных читателей. Она предоставляет

хорошую, во многом, заочную возможность познакомиться с современными достижениями в области масс-спектрометрии биомолекул, поскольку большинство описываемых в ней методов пока не используется в нашей стране.

Предлагаемая читателям книга "Основы масс-спектрометрии белков и пептидов" является первым учебным пособием на русском языке, излагающим основы масс-спектрометрии белков и пептидов. Книга написана в формате лекций для начинающих, иллюстрирована большим количеством рисунков, спектров, схем и сопровождается представительным списком цитированной литературы. Она рассчитана на студентов и аспирантов химических, физико-химических, биологических и медицинских специальностей; будет полезна научным сотрудникам, уже работающим в области исследований белков и пептидов или интересующимся этим научным направлением.

Цель издания такой книги - заинтересовать молодых исследователей информативной, очень красивой и востребованной во всем мире дисциплиной, дать возможность более эффективно применять масс-спектрометрию для решения своих собственных фундаментальных и прикладных научных задач.

Основное внимание в учебном пособии уделено методам ионизации белков и пептидов, процессам фрагментации этих соединений в газовой фазе. Достаточно подробно рассматриваются вопросы тандемной масс-спектрометрии, существующие методы инициирования фрагментации. Этот раздел очень важен в современной масс-спектрометрии. Он полезен для исследователей, работающих с любыми химическими соединениями и биополимерами. Несколько глав посвящены идентификации белков и пептидов. Сюда входят варианты автоматизированной идентификации, расшифровка спектров вручную, описание определенных сложностей масс-спектрометрического секве-нирования и вариантов их преодоления. Рассмотрены достоинства и недостатки двух основных подходов установления химической структуры белков: масс-спектрометрии "сверху-вниз" и "снизу-вверх". Отдельная глава посвящена вопросам количественного анализа.

Книга посвящена Александру Леонидовичу Курцу и Киму Петровичу Бутину, двум друзьям, замечательным профессорам химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, очень близких нам в человеческом отношении, непосредственно участвовавшим в нашем химическом и гуманитарном образовании. Мы всегда высоко оценивали химическую эрудицию и потрясающие личностные качества этих ученых. Именно общение с этими людьми вдохновило нас в самом начале XXI века начать исследования в области масс-спектрометрии пептидов.

А.Т. Лебедев
К.А. Артеменко
Т.Ю. Самгина