Основной белок миелина. Белковый и липидный состав миелина, белого и серого вещества человека. Прогноз по заболеваниям

Заболевания, одним из основных проявлений которых является разрушение миелина, - одна из наиболее актуальных проблем клинической медицины, преимущественно неврологии. В последние годы наблюдается отчетливое увеличение числа случаев заболеваний, сопровождающихся повреждением миелина.

Миелин - особый вид клеточной мембраны, окружающей отростки нервных клеток, в основном аксоны, в центральной (ЦНС) и периферической нервной системе (ПНС).

Основные функции миелина:
питание аксона
изоляция и ускорение проведения нервного импульса
опорная
барьерная функции.

По химическому составу миелин - это липопротеидная мембрана, состоящая из биомолекулярного липидного слоя, расположенного между мономолекулярными слоями белков, спирально закрученная вокруг интернодального сегмента нервного волокна.

Липиды миелина представлены фосфолипидами, гликолипидами и стероидами. Все эти липиды построены по единому плану и обязательно имеют гидрофобный компонент ("хвост") и гидрофильную группу ("головку").

Белки составляют до 20% сухой массы миелина. Они бывают двух видов: белки, расположенные на поверхности, и белки, погруженные в липидные слои или пронизывающие мембрану насквозь. Всего описано более 29 белков миелина. Основной белок миелина (ОБМ), протеолипидный белок (ПЛП), миелин-ассоциированный гликопротин (МАГ) составляют до 80% массы белка. Они выполняют структурную, стабилизирующую, транспортную функции, обладают выраженными иммуногенными и энцефалитогенными свойствами. Среди мелких белков миелина особое внимание заслуживает миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (МОГ) и ферменты миелина, имеющие большое значение в поддержании структурно-функциональных взаимоотношений в миелине.

Миелины ЦНС и ПНС отличаются по своему химическому составу
в ПНС миелин синтезируется шванновскими клетками, причем несколько клеток синтезируют миелин для одного аксона. Одна шванновская клетка образует миелин только для одного сегмента между участками без миелина (перехватами Ранвье). Миелин ПНС заметно толще, чем в ЦНС. Такой миелин имеют все периферические и черепные нервы, только короткие проксимальные сегменты черепных нервов и спинно-мозговых корешков содержат миелин ЦНС. Зрительный и обонятельный нервы содержат преимущественно центральный миелин
в ЦНС миелин синтезируется олигодендроцитами, причем одна клетка принимает участие в миелинизации нескольких волокон.

Разрушение миелина является универсальным механизмом реакции нервной ткани на повреждение.

Болезни миелина подразделяются на две основные группы
миелинопатии - связаны с биохимическим дефектом строения миелина, как правило, генетически обусловленным

Миелинокластии - в основе миелинокластических (или демиелинизирующих) заболеваний лежит разрушение нормально синтезированного миелина под влиянием различных воздействий, как внешних, так и внутренних.

Подразделение на эти две группы весьма условно, так как первые клинические проявления миелинопатий могут быть связаны с воздействием различных внешних факторов, а миелинокластии вероятнее всего развиваются у предрасположенных лиц.

Наиболее распространенное заболевание из всей группы болезней миелина - рассеянный склероз. Именно с этим заболеванием приходится наиболее часто проводить дифференциальную диагностику.

Наследственные миелинопатии

Клинические проявления большинства этих заболеваний чаще отмечаются уже в детском возрасте. В то же время имеется ряд заболеваний, которые могут начинаться в более позднем возрасте.

Адренолейкодистрофии (АЛД) связаны с недостаточностью функции коры надпочечников и характеризуются активной диффузной демиелинизацией различных отделов как ЦНС, так и ПНС. Основной генетический дефект при АЛД связан с локусом на Х-хромосоме - Xq28, генетический продукт которого (белок ALD-P) является пероксисомальным мембранным белком. Тип наследования в типичных случаях - рецессивный, зависимый от пола. В настоящее время описано более 20 мутаций в разных локусах, связанных с разными клиническими вариантами АЛД.

Основной метаболический дефект при этом заболевании - увеличение содержания в тканях насыщенных жирных кислот с длинной цепью (особенно С-26) , что приводит к грубым нарушениям структуры и функций миелина. Наряду с дегенеративным процессом в патогенезе болезни существенное значение имеет хроническое воспаление в ткани мозга, связанное с повышенной продукцией фактора некроза опухолей альфа (ФНО-a). Фенотип АЛД определяется активностью этого воспалительного процесса и вероятнее всего обусловлен как различным набором мутаций на Х-хромосоме, так и аутосомной модификацией влияния дефектного генетического продукта, т.е. сочетанием основного генетического дефекта в половой Х-хромосоме со своеобразным набором генов на других хромосомах.

По типу наследования и особенностям начала АЛД классифицируют на

Сцепленные с Х-хромосомой АЛД у детей
сцепленные с Х-хромосомой АЛД у взрослых
аутосомнорецессивные неонатальные АЛД.

Клинические варианты адренолейкодистрофий можно разделить на две основные группы

Преимущественно церебральные формы
преимущественно полиневропатические, развивающиеся чаще у взрослых.

В зависимости от преобладающего симптомокомплекса в составе АЛД помимо полиневритического выделяют несколько клинических вариантов:
1) прогрессирующая энцефалопатия с корковой слепотой у молодых людей;
2) прогрессирующая миелопатия у зрелых мужчин;
3) энцефалопатия в сочетании с миелопатией;
4) злокачественная энцефалопатия у новорожденных мальчиков;
5) преимущественно эндокринологические нарушения (болезнь Аддисона), сцепленные с Х-хромосомой и сопровождающиеся умеренными неврологическими нарушениями;
6) миелопатия у женщин - носительниц патологического гена и др.

В типичных случаях церебральными формами АЛД страдают мальчики 3 - 15 лет, отмечаются прогрессирующие нарушения движений, снижение зрения, слуха, типичные судорожные синдромы и деменция. Отдельные симптомы энцефалопатии и миелопатии могут быть выявлены и у гетерозиготных женщин - носительниц патологического гена.

Среди более редких полиневритических форм выделяют адреномиелоневропатию, которая может начинаться в возрасте 25 - 35 лет и характеризуется прогрессирующей миелопатией и полиневропатией. Клинические проявления: нарастающая слабость в ногах, нарушения чувствительности по полиневритическому типу ("носки" и "перчатки"), нарушения координации. Для проведения дифференциальной диагностики большое значение имеет семейный анамнез, неуклонно прогрессирующий тип течения заболевания, снижение в крови содержания адреналина и увеличение длинноцепочечных жирных кислот.

В последнее время все большую роль в мониторинге активности патологического процесса при различных вариантах АЛД приобретают магнитно-резонансная томография.

Эффективного специфического лечения АЛД пока нет , проводится симптоматическая терапия. Сейчас разрабатываются подходы к проведению генетического консультирования как метода профилактики АЛД на основе скрининга мутаций в гене белка ALD и других локусах для выявления носительниц патогенных мутаций.

Описана поздняя форма суданофильной лейкодистрофии Пелицеуса-Мерцбахера с началом заболевания на втором десятилетии жизни . Выраженное демиелинизирующее поражение головного мозга у этих больных сопровождается снижением содержания эфиров холестерина. У этих больных прогрессивно нарастают нарушения координации, спастические парезы, интеллектуальные нарушения.

Поздние формы этой лейкодистрофии имеют часто благоприятное течение, и их, как правило, очень сложно дифференцировать от рассеянного склероза.

Болезнь Александера - редкое заболевание, преимущественно наследуемое по аутосомно-рецессивному типу входит в группу лейкодистрофий которые характеризуются демиелинизацией с диффузной волокнистой дегенерацией белого вещества головного мозга и образованием в ткани мозга глобоидных клеток.

Эта дисмиелинопатия характеризуется тем, что в миелине вместо галактолипидов и цереброзидов накапливаются глюколипиды.

Для нее характерны
постепенно нарастающие спастические параличи
снижение остроты зрения
деменция
эпилептический синдром
гидроцефалия.

В ткани мозга при болезни Александера помимо диффузной демиелинизации выявляются полости и гиалинозные уплотнения волокон вокруг сосудов мозга.

Заболевание может начинаться в любом возрасте, на ранних стадиях возможно ремиттирующее течение.

Прогноз крайне неблагоприятный , хотя и описаны медленно прогрессирующие варианты, близкие по течению к рассеянному склерозу.

К группе глобоидо-клеточных лейкодистрофий также относятся такие редкие заболевания, как болезнь Краббе и болезнь Канавана . Эти заболевания редко развиваются во взрослом возрасте.
Клинически они характеризуются прогрессирующим поражением миелина разных отделов ЦНС с развитием парезов, нарушений координации, деменции, слепоты, эпилептическим синдромом. Исследования лейкоцитов крови или фибробластов кожи часто выявляют дефицит фермента b-галактоцереброзидазы.

В разном возрасте могут начинаться так называемые болезни митохондрий с поражением ЦНС и развитием митохондриальных лейкоэнцефалопатий . Различные мутации, в том числе в митохондриальной ДНК, могут вызывать ферментативные дефекты и нарушать процессы транспорта и утилизации веществ, сохранения и передачи энергии, нарушать дыхательную цепь.

Для митохондриальных энцефалопатий характерн о повышение содержания лактата и пирувата в плазме крови и спинно-мозговой жидкости, в митохондриях. Эти нарушения могут приводить к развитию полиморфной неврологической симптоматики, иногда сходной с симптомами рассеянного склероза. Часто митохондриальная энцефалопатия проявляется слабостью и быстрой утомляемостью мышц, офтальмоплегией и другими симптомами.

Миелинокластические заболевания

Среди миелинокластических заболеваний особого внимания заслуживают вирусные инфекции , в патогенезе которых большое значение имеет разрушение миелина. Это в первую очередь
нейроСПИД , вызываемый вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), и связанные с ним поражения нервной системы
тропический спинальный парапарез (ТСП) , вызываемый ретровирусом HTLV-I.

Патогенез первичного поражения ЦНС при нейроСПИДе связан с непосредственным нейротоксическим воздействием вируса, а также с патологическим действием цитотоксических Т-клеток, противомозговых антител и нейротоксических веществ, вырабатываемых инфицированными иммуноцитами. Прямое поражение мозга при ВИЧ-инфекции приводит к развитию подострого энцефалита с участками демиелинизации. При этом в ткани мозга могут быть выявлены моноциты и макрофаги с большим количеством вируса. Эти клетки сливаются в гигантские многоядерные образования с огромным количеством вирусного материала (синцитии), что и явилось причиной обозначения этого энцефалита как гигантоклеточного. В то же время характерным для этой инфекции является несоответствие тяжести клинических проявлений и выраженности патоморфологических изменений. У многих больных с отчетливыми клиническими проявлениями ВИЧ-ассоциированной деменции патоморфологически может выявляться только "побледнение" миелина и слабовыраженный центральный астроглиоз.

Клинически наиболее часто при ВИЧ-инфекции отмечается так называемый ВИЧ-ассоциированный познавательно-двигательный комплекс.
В этот комплекс, обозначаемый ранее как СПИД-деменция, включают три заболевания:
ВИЧ-ассоциированную деменцию
ВИЧ-ассоциированную миелопатию
ВИЧ-ассоциированные минимальные познавательно-двигательные расстройства.

При наиболее частом синдроме, ВИЧ-демен ции, выявляется замедление психомоторных процессов, невнимательность, снижение памяти. В последующем деменция быстро прогрессирует, возможно присоединение очаговых неврологических симптомов. При ВИЧ-ассоциированной вакуольной миелопатии преобладают двигательные расстройства, преимущественно в нижних конечностях, связанные с поражением спинного мозга.

У больных с иммунодефицитами разного генеза может развиваться прогрессирующая мультифокальная лейкоэнцефалопатия (ПМЛ) , которая вызывается полиомавирусом (вирус JC из группы паповавирусом). Кроме больных СПИД, эта инфекция может иметь место у больных с саркоидозом, туберкулезом, СКВ, лимфомой, лейкемией, при иммунодефицитах после пересадки почки. Вирус выявляется в олигодендроцитах и астроцитах, причем последние могут сливаться, образуя гигантские клетки. В патогенезе демиелинизации имеет значение как непосредственное поражение олигодендроцитов, так и аутоиммунные реакции на фоне иммунодефицита. Для ПМЛ характерно неуклонно прогрессирующее течение с ранним развитием деменции, экстрапирамидными нарушениями, дезориентацией в месте и времени. Решающее значение в диагностике ПМЛ имеет выявление в клетках спинно-мозговой жидкости JC-вируса.

Хроническое воспаление в белом веществе мозга с развитием демиелинизации характерно для ТСП (тропического спинального парапареза) или HTLV-1 миелопатии . Это эндемическое для стран Юго-Восточной Азии заболевание характеризуется неуклонно прогрессирующим нижним парапарезом. При проведении МРТ у больных с ТСП могут выявляться и субклинические очаги демиелинизации в головном мозге. Диагностическое значение имеет выявление ретровируса HTLV-I или антител к нему.

Лечение всех вирусных инфекций основано на использовании противовирусных препаратов, останавливающих размножение вируса в инфицированных клетках.

У лиц с кахексией, страдающих хроническим алкоголизмом, тяжелыми хроническими заболеваниями печени и почек, при диабетическом кетоацидозе, при проведении реанимационных мероприятий может развиваться тяжелое демиелинизирующее заболевание - острый или подострый центральный понтийный и/или экстрапонтийный миелинолиз.

При этом заболевании симметричные билатеральные очаги демиелинизации образуются в подкорковых узлах и стволе головного мозга. Предполагается, что основой этого процесса является нарушение в балансе электролитов, в первую очередь ионов Na.

Особенно высок риск развития миелинолиза при быстрой коррекции гипонатрийемии.

Клинически этот синдром может проявляться как минимальными неврологическими симптомами, так и тяжелыми альтернирующими синдромами и развитием комы. Заболевание обычно через несколько недель заканчивается смертью, но в ряде случаев массивные дозы кортикостероидов предотвращают летальный исход.

После облучения, химио- и радиотерапии может развиваться токсическая лейкоэнцефалопатия с очаговой демиелинизацией в сочетании с мультифокальным некрозом. Возможно развитие
острых
ранних отсроченных
поздних демиелинизирующих процессов.

Последние начинаются через несколько месяцев или лет после облучения и характеризуются тяжелым течением с полиморфной очаговой неврологической симптоматикой. В патогенезе этих лейкоэнцефалопатий существенное значение имеют аутоиммунные реакции на антигены миелина, повреждение олигодендроцитов и, следовательно, нарушение ремиелинизации.

Токсическое повреждение миелина может наблюдаться также при
порфирии
гипотиреозе
интоксикациях ртутью
свинцом
СО
цианидами
при всех видах кахексии
передозировке антиконвульсантов
изониазида
актиномицина
при употреблении героина и морфия

Особого внимания заслуживает ряд миелинокластических заболеваний, которые могут быть классифицированы как особые варианты рассеянного склероза.

Начало рассеянного склероза клинически крайне сложно отличить от острого рассеянного энцефаломиелита (ОРЭМ) - аутоиммунного воспалительного заболевания ЦНС, развивающегося, как правило, после инфекций или вакцинаций. Дифференцировать от рассеянного склероза во многих случаях можно только на основе данных динамического наблюдения
при ОРЭМ процесс всегда однофазный, т.е. острый
при РС - хронический.

В большинстве случаев ОРЭМ развивается после инфекционного заболевания или вакцинации.

Среди поствакцинальных энцефалитов особенно часто описывают энцефалиты после введения вакцин против коклюша и оспы, а также после антирабических прививок.

ОРЭМ может развиваться после или во время
вирусных заболеваний (кори, краснухи, оспы, ветряной оспы, эпидемического паротита, инфекционного мононуклеоза, герпетической инфекции, гриппа)
реже - при микоплазменной
другой бактериальной инфекции.

Патогенез заболевания основан на развитии аутоиммунной реакции и острого воспаления из-за перекрестных реакций между антигенами вирусов (реже бактерий) и антигенами мозга.

В типичных случаях имеется латентный период в 4 - 6 дней. Заболевание начинается остро или подостро, с общеинфекционной, общемозговой и очаговой симптоматики, в тяжелых случаях - с судорожным синдромом и нарушением сознания.

Часто ОРЭМ сочетается с острым полиневритом по типу моторного полиневрита Гийена - Барре.

На МРТ при ОРЭМ появляются множественные очаги повышенной интенсивности на Т2-взвешенных изображениях, активно накапливающие контраст в Т1-режиме. Эти очаги очень близки к наблюдаемым при рассеянном склерозе, но при ОРЭМ они часто больше по размеру, иногда симметричны, с вовлечением таламуса и базальных ядер. При ОРЭМ на повторных томограммах не отмечается появления новых очагов, как при рассеянном склерозе, а наоборот, ряд очагов может уменьшаться в размерах.

Лечение ОРЭМ основано на использовании пульс-доз кортикостероидов и адекватной симптоматической терапии. В ряде случаев зарегистрирован хороший клинический эффект от использования плазмофереза, больших доз иммуноглобулина класса G (IgG) внутривенно.

(!!!) Злокачественные формы ОРЭМ с развитием множественных геморрагий в ткань мозга иногда классифицируют как острые геморрагические лейкоэнцефалиты или болезнь Херста.

Особый вариант рассеянного склероза был описан Девисом в 1894 г. и получил название оптикомиелит Девика . Для этого заболевания характерны симптомы поражения спинного мозга (поперечный миелит) и зрительных нервов с одной или двух сторон, а также злокачественное неуклонно прогрессирующее течение и плохой прогноз. Наиболее часто случаи болезни Девиса встречаются у женщин коренных национальностей стран Юго-Восточной Азии. Патоморфологически очаги демиелинизации при этом заболевании близки к рассеянному склерозу, но иногда наблюдаются нетипичные для последнего диффузные воспалительные изменения с выраженным отеком ткани мозга и в редких случаях с геморрагиями. Данные МРТ и аутопсии свидетельствуют о возможности образования бляшек не только в спинном мозге и зрительных нервах, но и в перивентрикулярном белом веществе, редко в стволе мозга и мозжечке. В патогенезе оптикомиелита Девиса большое значение имеют гуморальные аутоиммунные реакции с образованием антител к различным антигенам нервной ткани.

Концентрический склероз, или болезнь Балло , является неуклонно прогрессирующим демиелинизирующим заболеванием лиц молодого возраста. При этом заболевании образуются большие очаги демиелинизации преимущественно в белом веществе лобных долей, иногда с вовлечением серого вещества. Очаги состоят из чередующихся областей полной и частичной демиелинизации с выраженным ранним поражением олигодендроцитов. Зоны демиелинизации и ремиелинизации при этом расположены концентрически или хаотично; это придает очагам на томограммах характерный вид. До внедрения МРТ диагноз болезни Балло подтверждался только при аутопсии. Прогноз крайне неблагоприятен. В последние годы получены данные об улучшении в состоянии больных на фоне активной иммуносупрессии, что делает прогноз не столь фатальным, как ранее.

Лейкоэнцефалитом Шильдера чаще болеют дети, хотя нередко это заболевание начинается во взрослом возрасте. Для него характерна распространенная неуклонно прогрессирующая демиелинизация с образованием сливных зон воспаления и разрушения миелина. Типично распространение такой зоны демиелинизации с одного полушария на другое через мозолистое тело. Клиническая картина болезни Шильдера зависит от объема и локализации поражения.

Характерно развитие
эпилептического синдрома,
психозов,
центральных парезов,
гиперкинезов, атаксии,
снижения зрения,
деменции,
псевдобульбарного синдрома.

Другим злокачественным вариантом рассеянного склероза является болезнь Марбурга , описанная как прогрессирующее заболевание с острым началом, преимущественным поражением ствола мозга, крайне злокачественным, с быстро прогрессирующим течением и быстрым смертельным исходом. Помимо ствола мозга, множественные очаги демиелинизации при этом заболевании часто локализуются в зрительных нервах и шейном отделе спинного мозга. Патоморфологические очаги демиелинизации при болезни Марбурга характеризуются быстрым развитием дегенерации аксонов, иногда некрозом. Активная иммуносупрессия в ряде случаев способствовала наступлению ремиссии, что подтверждает общность болезни Марбурга и рассеянного склероза.

(!!!) Следует отметить, что очаги демиелинизации в ЦНС довольно часто выявляются у больных с
-системной красной волчанкой
-первичным синдромом Шегрена
-васкулитами различного генеза и другими системными аутоиммунными заболеваниями.

Разрушение миелина и развитие аутоиммунных реакций на его компоненты наблюдается при многих сосудистых и паранеопластических процессах в ЦНС , что следует учитывать при проведении дифференциального диагноза.

6. БЕЛКИ МИЕЛИНА

Белковый состав миелина своеобразен, но существенно проще, чем в нейронах и глиальных клетках.

В миелине велика доля катионного белка – КБМ. Он представляет собой относительно небольшой полипептид с М г = 16–18 кД. КБМ содержит значительную долю диаминокислот и в то же время около половины составляющих его аминокислот – неполярные. Это обеспечивает, с одной стороны, тесный контакт с гидрофобными компонентами липидов миелина, а с другой стороны, определяет его способность к образованию ионных связей с кислыми группировками липидов.

Необычайно высокой гидрофобностью характеризуются так называемые протеолипидные белки Фолча, составляющие большую часть остальных белков миелина. В свою очередь, главный из этих белков – липофилин, в котором 2/3 составляющих аминокислот – неполярные. Интересна определенная избирательность контактов липофилина с липидами, например, вытеснение холестерина из его окружения. Полагают, что это связано с особенностями вторичной структуры липофилина.

Довольна велика также доля так называемого белка Вольфграма – кислого протеолипида, довольно богатого остатками дикарбоновых аминокислот, и, в то же время, содержащего около половины остатков неполярных аминокислот.

Наконец, из нескольких десятков других белков миелина отметим миелинассоциированный гликопротеин, расположенный на экстраделлюлярной поверхности мембран; он встречается, кроме того, в олигодендроцитах до миелинизации и в миелине периферической нервной системы. В ЦНС человека он представлен тремя полипептидными цепями с М г =92, 107, 113 кД, а в периферической нервной системе – одним белком с М г =107 кД. МАГ относится к гликопротеинам с относительно низким содержанием углеводных остатков – около 30% от массы молекулы, но содержит характерный для гликопротеинов набор углеводов: N‑ацетилглюкозамин, N‑ацетилнейраминовая кислота, фукоза, манноза и галактоза. Для белковой части молекулы характерно высокое содержание глутаминовой и асларагиновой кислот.

Функции белка Вольфграма и МАГ неизвестны, если не считать общих соображений об их участии в организации структуры миелиновых оболочек.

7. НЕЙРОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ БЕЛКИ ГЛИИ

Белок S‑100 содержится и в нейронах, и в глиальных клетках, причем доля его в последних велика – около 85%.

В 1967 г. из а 2 -глобулинов мозга был выделен нейроспеци-фический а 2 -гликопротеин с молекулярной массой 45 кД. В мозге человека он появляется на 16‑й неделе эмбрионального развития. Углеводные компоненты его включают глюкозамин, маннозу, глюкозу, галактозу, галактозамин и N‑ацетилнейраминовую кислоту. а 2 -гликопротеин локализован только в астроцитах, но отсутствует в нейронах, олигодендроцитах и в клетках эндотелия. Поэтому его можно рассматривать как один из специфических маркеров астроцитов.

Другой белок опять-таки характерен только для клеток глии. Он был выделен из богатых фиброзными астроцитами областей головного мозга человека, а впоследствии – в значительно больших количествах – из мозга больных множественным склерозом. Это вещество было названо глиальным фибриллярным кислым белком. Он специфичен только для ЦНС, а в ПНС он не обнаружен. Содержание его в белом веществе головного мозга превышает таковое в сером веществе. В онтогенезе мышей максимальное содержание GFA наблюдается между 10‑м и 14‑м днями постнатального развития, т.е. совпадает по времени с периодом миелинизации и пиком дифференцировки астроцитов. Молекулярная масса белка составляет 40–54 кД. Глиальная локализация этого белка также позволяет использовать его как «маркерный» белок для этих клеток.

Функции а 2 -гликопротеина и белка GFA неизвестны.

Что касается белков микроглии, то следует иметь в виду участие этих клеток в построении миелина. Многие из белков миелина, выявлены в микроглии.

В глии представлены также многие рецепторные и ферментные белки, участвующие в синтезе вторичных мессенджеров, предшественников нейромедиаторов и других регуляторных соединений, которые могут быть отнесены к нейроспецифическим.

8. ИНТЕНСИВНОСТЬ МЕТАБОЛИЗМА БЕЛКОВ В РАЗЛИЧНЫХ ОТДЕЛАХ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

Современное представление о динамическом состоянии белков в нервной ткани было установлено благодаря применению изотопов А.В. Палладиным, Д. Рихтером, А. Лайтой и другими исследователями. Начиная с конца 50‑х и в течение 60‑х годов при изучении метаболизма белка использовались различные предшественники их биосинтеза, меченые С, Н, S. При этом было показано, что белки и аминокислоты в головном мозге взрослого животного метаболируют, в общем, более интенсивно, чем в других органах и тканях.

Например, в опытах in vivo при применении в качестве предшественника равномерно меченой С‑1–6‑глюкозы оказалось, что по интенсивности образования аминокислот за счет глюкозы ряд органов можно расположить в следующем порядке:

головной мозг > кровь > печень > селезенка и легкие > мышца.

Аналогичная картина наблюдалась при использовании и других меченых предшественников. Показано, что из С-ацетата в головном мозге интенсивно синтезируется углеродный скелет аминокислот, особенно моноаминодикарбоновых кислот и прежде всего глутамата; из моноаминомонокарбновых кислот достаточно интенсивно образуются глицин, аланин, серии и др. Следует отметить, что особое место в метаболизме аминокислот занимает глутамат. В опытах in vitro с использованием меченого глутамата показано, что если в реакционную среду гомогената мозга добавить только одну глутаминовую кислоту, то она может быть источником образования 90–95% аминокислот.

Были проведены многочисленные исследования по изучению различий в интенсивности метаболизма суммарных и индивидуальных белков с помощью меченых предшественников. В опытах in vivo при использовании С-глутамата было показано, что он включается в 4–7 раз интенсивнее в белки серого вещества, чем белого. Во всех случаях интенсивность обмена суммарных белков серого вещества больших полушарий мозга и мозжечка оказалась значительно выше, чем белого вещества тех же отделов мозга, какой бы предшественник ни применялся при исследовании. При этом различие интенсивности обмена суммарных белков серого вещества по сравнению с белками белого вещества имеет место не только в норме, но, как правило, и при различных функциональных состояниях организма.

Проводились также исследования по изучению различий в интенсивности включения меченых предшественников в суммарные белки центральной и периферической нервной систем. Оказалось, что несмотря на существенные различия в составе, метаболизме и функциональной деятельности различных отделов ЦНС и ПНС, а также на сложность и гетерогенность белков, входящих в их состав, суммарные белки ЦНС взрослых животных обновляются значительно интенсивнее, чем суммарные белки ПНС.

Много исследований посвящено метаболизму белков в различных отделах головного мозга. Например, при изучении распределения радиоактивности в головном мозге после введения С-глутамата оказалось, что на долю серого вещества больших полушарий приходится 67,5 радиоактивности, мозжечка – 16,4, продолговатого мозга – 4,4, на долю других отделов головного мозга – около 11,7. В опытах in vivo при введении взрослым животным различных предшественников, а именно С-глутамата, С‑1–6‑глюкозы, С‑2‑ацетата, оказалось, что по интенсивности включения метки в суммарные белки различные отделы нервной системы располагаются в такой последовательности: серое вещество больших полушарий и мозжечка > таламус > зрительный бугор > средний и промежуточный мозг > Варолиев мост > продолговатый мозг > белое вещество больших полушарий и мозжечка > спинной мозг > седалищный нерв > миелин.

Проводились также исследования, посвященные изучению интенсивности обмена белков в различных отделах ЦНС с использованием авторадиографического метода. Получена аналогичная картина: наиболее интенсивное включение метки имело место в белках серого вещества больших полушарий и мозжечка, медленное – в спинном мозге и еще более медленное – в белках седалищного нерва. Что же касается подкорковых образований, то интенсивность обмена их белков была средней между скоростью обновления белков серого и белого вещества больших полушарий и мозжечка. Между отдельными подкорковыми образованиями наблюдаются менее существенные различия, чем между метаболической активностью белого и серого вещества.

Исследовались также суммарные белки различных областей коры больших полушарий – лобной, височных, теменной и затылочной. По данным Вэлша и ВАПалладина, более высокой обновляемостью обладают белки сенсорной области коры, а более низкой – белки височной доли коры больших полушарий. Эти же авторы показали, что более высокая обновляемость белков характерна для филогенетически более молодых и функционально более активных структурных образований мозга.

На фоне, в общем, высокой обновляемое белков мозга особого упоминания заслуживают немногие довольно инертные белки. К ним относятся гистоны нейронов неокортекса-катионные белки хроматина этих клеток. Во взрослом организме нейроны-неокортекса не размножаются. В соответствии с этим темп обновления гистонов очень незначителен. Среднестатистические сроки обновления половины молекул некоторых фракций гистонов измеряются десятками суток.

В головном мозге отсутствуют абсолютно инертные белки, а индивидуальные белки и белковые комплексы нейронов претерпевают непрерывную перестройку, связанную с их участием в функциональной деятельности нейронов и нейроглии. Помимо синтеза и распада целых белковых молекул происходят изменения в их структуре, происходящие, в частности, при аминировании и дезаминировании белков мозга. Их следует рассматривать как частичное обновление отдельных фрагментов белковой молекулы.

1. В нервной ткани обнаружены характерные только для нее нейроспецифические белки. По химической природе они могут быть кислыми или основными, простыми или сложными, часто они представляют собой гликопротеины или фосфопротеины. Многие нейроспецифические белки имеют субъединичную структуру. Число открытых нейроспецифических белков уже превысило 200 и быстро возрастает.

2. Нейроспецифические белки прямо или косвенно участвуют в осуществлении всех функций нервной системы – генерации и проведении нервного импульса, процессах переработки и хранении информации, синаптической передаче, клеточном узнавании, рецепции и др.

3. По локализации в ткани нервной системы различают исключительно или преимущественно нейрональные и глиальные нейроспецифические белки. По субклеточной локализации они могут быть цитопяазматическими, ядерными или мембрано-связанными. Особое значение имеют нейроспецифические белки, локализованные в мембранах синаптических образований.

4. Многие кислые кальиий связывающие нейроспецифические белки участвуют в процессах транспорта ионов. Предполагается, что, в частности, они играют значительную роль в формировании памяти.

5. Особую группу нейроспецифических белков представляют сократительные белки нервной ткани, которые обеспечивают ориентацию и подвижность цитоструктурных образований, активный транспорт ряда компонентов нейрона и участвуют в нейромедиаторных процессах в синапсах.

6. К группе нейроспецифических белков, связанных с гуморальной регуляцией, осуществляемой головным мозгом, относятся некоторые гликопротеины гипоталамуса, а также нейрофизины и подобные им белки, являющиеся носителями пептидных регуляторов.

7. Разнообразные нейроспецифические гликопротеины участвуют в формировании миелина, в процессах клеточной адгезии, нейрорецепции и взаимном узнавании нейронов в онтогенезе и при регенерации.

8. Ряд нейроспецифических белков представляет собой мозговые изоэнзимы известных ферментов, например енолазы, альдолазы, креатинкиназы и др.

9. Многие нейроспецифические белки весьма активно метаболируют в головном мозге животных, причем интенсивность метаболизма различна в разных отделах мозга и зависит от функционального состояния нервной системы. В целом по интенсивности обновления белки мозга значительно превосходят белки других тканей и органов.

Нервная система выполняет важнейшие функции в организме. Она отвечает за все действия и мысли человека, формирует его личность. Но вся эта сложная работы была бы невозможна без одной составляющей — миелина.

Миелин – это вещество, образующее миелиновую (мякотную) оболочку, которая отвечает за электроизоляцию нервных волокон и скорость передачи электрического импульса.

Анатомия миелина в строении нерва

Главная клетка нервной системы – нейрон. Тело нейрона называется сома. Внутри нее находится ядро. Тело нейрона окружено короткими отростками, которые называются дендриты. Они отвечают за связь с другими нейронами. От сомы отходит один длинный отросток – аксон. Он несет импульс от нейрона к другим клеткам. Чаще всего на конце он соединяется с дендритами других нервных клеток.

Всю поверхность аксона покрывает миелиновая оболочка, которая представляет собой отросток клетки Шванна, лишенный цитоплазмы. По сути, это несколько слоев клеточной мембраны, обернутые вокруг аксона.

Шванновские клетки, обволакивающие аксон, разделяются перехватами Ранвье, в которых отсутствует миелин.

Функции

Основными функциями миелиновой оболочки являются:

• изоляция аксона;
• ускорение проведения импульса;
• экономия энергии за счет сохранения ионных потоков;
• опора нервного волокна;
• питание аксона.

Как работают импульсы

Нервные клетки изолированы благодаря своей оболочке, но все же взаимосвязаны между собой. Участки, в которых клетки соприкасаются, называются синапсы. Это место, где встречаются аксон одной клетки и сома или дендрит другой.

Электрический импульс может передаваться внутри одной клетки или от нейрона к нейрону. Это сложный электрохимический процесс, который основан на перемещении ионов через оболочку нервной клетки.

В спокойном состоянии внутрь нейрона попадают только ионы калия, а ионы натрия остаются снаружи. В момент возбуждения они начинаются меняться местами. Аксон положительно заряжается изнутри. Затем натрий перестает поступать через мембрану, а отток калия не прекращается.

Изменение напряжения из-за движения ионов калия и натрия называется «потенциал действия». Он распространяется медленно, но миелиновая оболочка, обволакивающая аксон, ускоряет это процесс, препятствуя оттоку и притоку ионов калия и натрия из тела аксона.

Проходя через перехват Ранвье, импульс перескакивает с одного участка аксона на другой, что и позволяет ему двигаться быстрее.

После того, как потенциал действия пересекает разрыв в миелине, импульс останавливается, и возвращается состояние покоя.

Такой способ передачи энергии характерен для ЦНС. Что касается вегетативной нервной системы, в ней часто встречаются аксоны, покрытые малым количеством миелина или вообще не покрытые им. Скачки между шванновскими клетками не осуществляются, и импульс проходит гораздо медленнее.

Состав

Миелиновый слой состоит из двух слоев липидов и трех слоев белка. Липидов в нем гораздо больше (70-75%):

• фосфолипиды (до 50%);
• холестерин (25%);
• глактоцереброзид (20%) и др.

Белковые слои тоньше липидных. Содержание белка в миелине – 25-30%:

• протеолипид (35-50%);
• основной белок миелина (30%);
• белки Вольфграма (20%).

Существуют простые и сложные белки нервной ткани.

Роль липидов в строении оболочки

Липиды играют ключевую роль в строении мякотной оболочки. Они являются структурным материалом нервной ткани и защищают аксон от потери энергии и ионных потоков. Молекулы липидов обладают способностью восстанавливать ткани мозга после повреждений. Липиды миелина отвечают за адаптацию зрелой нервной системы. Они выступают в роли рецепторов гормонов и осуществляют коммуникацию между клетками.

Роль белков

Немаловажное значение в строении миелинового слоя имеют молекулы белков. Они наряду с липидами выступают в роли строительного материала нервной ткани. Их главной задачей является транспортировка питательных веществ в аксон. Также они расшифровывают сигналы, поступающие в нервную клетку и ускоряют реакции в ней. Участие в обмене веществ – важная функция молекул белка миелиновой оболочки.

Дефекты миелинизации

Разрушение миелинового слоя нервной системы – очень серьезная патология, из-за которой происходит нарушение передачи нервного импульса. Она вызывает опасные заболевания, зачастую несовместимые с жизнью. Существуют два типа факторов, влияющие на возникновение демиелинизации:

• генетическая предрасположенность к разрушению миелина;
• воздействие на миелин внутренних или внешних факторов.
• Демиелизация делится на три вида:
• острая;
• ремиттирующая;
• острая монофазная.

Почему происходит разрушение

Наиболее частыми причинами разрушения мякотной оболочки являются:

• ревматические болезни;
• существенное преобладание белков и жиров в питании;
• генетическая предрасположенность;
• бактериальные инфекции;
• отравление тяжелыми металлами;
• опухоли и метастазы;
• продолжительные сильные стрессы;
• плохая экология;
• патологии иммунной системы;
• длительный прием нейролептиков.

Заболевания вследствие демиелинизации

Демиелинизирующие заболевания центральной нервной системы:

1. Болезнь Канавана – генетическое заболевание, возникающее в раннем возрасте. Его характеризуют слепота, проблемы с глотанием и приемом пищи, нарушение моторики и развития. Также следствием этой болезни являются эпилепсия, макроцефалия и мышечная гипотония.
2. Болезнь Бинсвангера. Чаще всего вызвана артериальной гипертонией. Больных ожидают расстройства мышления, слабоумие, а также нарушения ходьбы и функций тазовых органов.
3. . Может вызвать поражения нескольких частей ЦНС. Ему сопутствуют парезы, параличи, судороги и нарушение моторики. Также в качестве симптомов рассеянного склероза выступают поведенческие расстройства, ослабление лицевых мышц и голосовых связок, нарушение чувствительности. Зрение нарушается, меняется восприятие цвета и яркости. Рассеянный склероз также характеризуется расстройствами тазовых органов и дистрофией ствола мозга, мозжечка и черепных нервов.
4. Болезнь Девика – демиелинизация в зрительном нерве и спинном мозге. Болезнь характеризуют нарушения координации, чувствительности и функций тазовых органов. Ее отличают серьезные нарушения зрения и даже слепота. В клинической картине также наблюдаются парезы, мышечная слабость и вегетативная дисфункция.
5. Синдром осмотической демиелинизации . Возникает из-за недостатка натрия в клетках. Симптомами выступают судороги, нарушения личности, потери сознания вплоть до комы и смерти. Следствием заболевания являются отек головного мозга, инфаркт гипоталамуса и грыжа ствола мозга.
6. Миелопатии – различные дистрофические изменения в спинном мозге. Их характеризуют мышечные нарушения, сенсорные расстройства и дисфункция тазовых органов.
7. Лейкоэнцефалопатия – разрушение миелиновой оболочки в подкорке головного мозга. Больных мучают постоянная головная боль и эпилептические припадки. Также наблюдаются нарушения зрения, речи, координации и ходьбы. Снижается чувствительность, наблюдаются расстройства личности и сознания, прогрессирует слабоумие.
8. Лейкодистрофия – генетическое нарушение метаболизма, вызывающее разрушение миелина. Течение болезни сопровождают мышечные и двигательные расстройства, параличи, нарушение зрения и слуха, прогрессирующее слабоумие.

Демиелинизирующие заболевания периферической нервной системы:

1. Синдром Гийена-Барре – острая воспалительная демиелинизация. Она характеризуется мышечными и двигательными нарушениями, дыхательной недостаточностью, частичным или полным отсутствием сухожильных рефлексов. Больные страдают заболеваниями сердца, нарушением работы пищеварительной системы и тазовых органов. Парезы и нарушения чувствительности так же являются признаками этого синдрома.
2. Невральная амиотрофия Шарко-Мари-Тута – наследственная патология миелиновой оболочки. Ее отличают нарушения чувствительности, дистрофия конечностей, деформация позвоночника и тремор.

Это лишь часть заболеваний, возникающих из-за разрушения миелинового слоя. Симптомы в большинстве случаев схожи. Точный диагноз можно поставить лишь после проведения компьютерной или магнитно-резонансной томографии. Немаловажную роль в постановке диагноза играет уровень квалификации врача.

Принципы лечения дефектов оболочки

Заболевания, связанные с разрушением мякотной оболочки, очень сложно лечить. Терапия направлена в основном на купирование симптомов и остановку процессов разрушения. Чем раньше диагностировано заболевание, тем больше шансов остановить его течение.

Возможности восстановления миелина

Благодаря своевременному лечению можно запустить процесс восстановления миелина. Однако, новая миелиновая оболочка не будет так же хорошо выполнять свои функции. Кроме того, болезнь может перейти в хроническую стадию, а симптомы сохранятся, лишь слегка сгладятся. Но даже незначительная ремиелинизация способна остановить ход болезни и частично вернуть утраченные функции.

Современные лекарственные средства, направленные на регенерацию миелина более эффективны, но отличаются очень высокой стоимостью.

Терапия

Для лечения заболеваний, вызванных разрушением миелиновой оболочки, используются следующие препараты и процедуры:

• бета-интерфероны (останавливают течение заболевания, снижают риск возникновения рецидивов и инвалидности);
• иммуномодуляторы (воздействуют на активность иммунной системы);
• миорелаксанты (способствуют восстановлению двигательных функций);

• ноотропы (восстанавливают проводниковую активность);
• противовоспалительные (снимают воспалительный процесс, вызвавший разрушение миелина);
• (предупреждают повреждение нейронов мозга);
• обезболивающие и противосудорожные препараты;
• витамины и антидепрессанты;
• фильтрация ликвора (процедура, направленная на очищение спинномозговой жидкости).

Прогноз по заболеваниям

В настоящее время лечение демиелинизации не дает стопроцентного результата, но учеными активно ведутся разработки лекарственных средств, направленных на восстановление мякотной оболочки. Исследования проводятся по следующим направлениям:

1. Стимуляция олигодендроцитов . Это клетки, производящие миелин. В организме, пораженном демиелинизацией, они не работают. Искусственная стимуляция этих клеток поможет запустить процесс восстановления разрушенных участков миелиновой оболочки.
2. Стимуляция стволовых клеток . Стволовые клетки могут превращаться в полноценную ткань. Есть вероятность, что они могут заполнять и мякотную оболочку.
3. Регенерация гематоэнцефалического барьера . При демиелинизации этот барьер разрушается и позволяет лимфоцитам негативно влиять на миелин. Его восстановление защищает миелиновый слой от атаки иммунной системы.

Возможно, в скором времени заболевания, связанные с разрушением миелина, перестанут быть неизлечимыми.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Анализ фрагментации основного белка миелина под действием протеасомы

А. В. Бачева1#, А. А. Белогуров2, Н. А. Пономаренко2, В. Д. Кнорре2, В. М. Говорун2,

М. В. Серебрякова3, А. Г. Габибов1,2

1 Химический факультет Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова, Москва

2 Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва

3 Протеомный центр РАМН, НИИ Физико-химической медицины Росздрава РФ # e-mail: [email protected]

РЕФЕРАТ Протеасома - это высокомолекулярный белковый комплекс, служащий для направленной деградации белков в эукариотических клетках. Одной из функций протеасом является генерация пептидов, которые затем экспонируются на клеточной мембране с помощью молекул комплексов гистосовместимости как первого, так и второго класса. Есть все основания полагать, что протеасома принимает непосредственное участие в процессе специфической деградации основного белка миелина (ОБМ), составляющего около 30 % всех белков миелиновой оболочки аксонов нейронов. Детали этого механизма остаются невыясненными. В представленной работе изучены особенности специфической деградации ОБМ протеасомой.

Нами было продемонстрировано, что основной белок миелина (не подвергавшийся убиквитинилированию) является хорошим субстратом как для 20S, так и для 26S протеасомы. Впервые были определены сайты протеолиза ОБМ протеасомой из мозга мышей линий Ва1Ь/С и SJL и показаны значительные различия в паттерне деградации данного нейроантигена, что может свидетельствовать о лучшей презентации фрагментов основного белка миелина на комплексах гистосовместимости в случае мышей, предрасположенных к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

ВВЕДЕНИЕ

Рассеянный склероз (РС) - хроническое нейродегенера-тивное заболевание аутоиммунной природы - представляет собой острую медико-социальную проблему, поскольку, как правило, поражает лиц молодого и среднего возраста. Проблема лечения РС остается далекой от разрешения, на сегодняшний день существуют лекарственные препараты, способные в некоторой степени замедлить течение РС, но не излечивать от этой патологии. Деградация нервных волокон, происходящая при рассеянном склерозе, протекает вследствие разрушения миелиновой оболочки нейронов. Одной из биохимических характеристик, которая отличает миелин от других биологических мембран, является высокое соотношение липид/белок. Белки составляют от 25 до 30 % массы сухого вещества миелиновой оболочки. Около 30 % всех белков миелина составляют три изоформы т. н. основного белка миелина (ОБМ). ОБМ является одним из основных аутоантигенов при РС. Ранее нами и другими исследователями было показано, что в деградации ОБМ могут принимать участие каталитические антитела , а также некоторые проте-

азы . Известно, что в любой эукариотической клетке существует специализированная органелла для направленной деградации белков - протеасома, представляющая собой высокомолекулярный белковый комплекс. Одной из функций протеасом является генерация пептидов, которые затем экспонируются на клеточной мембране с помощью молекул комплексов гистосовместимости (МНС) как первого, так и второго класса . Есть все основания полагать, что протеасома принимает непосредственное участие в процессе специфической деградации ОБМ. Детали этого механизма остаются невыясненными. В представленной работе нами были изучены особенности специфической деградации ОБМ протеасомой.

Известно, что 20S протеасома (мультикаталический протеиназный комплекс) - это олигомерная высокомолекулярная (700 кДа) протеиназа, которая может быть выделена индивидуально. Данный комплекс также является каталитическим ядром 26S протеасомы, в составе которой присутствуют одна или две регуляторных 19S субъединицы. Было показано, что и 20S и 26S протеасомы способны деградировать ОБМ . Вопрос о сайт-специфичности

BpeWR. МИНУТЫ

Рис. 1. Зависимость степени гидролиза ОБМ протеасомой от времени. Обозначения: о - 20S протеасома, - 26S протеасома, выделенные из печени аутбредных мышей

деградации ОБМ протеасомой оставался открытым. Кроме того, известно, что при многих воспалительных патологических процессах протеазный комплекс (конститутивная протеасома) переходит в форму иммунопротеасомы, обладающей альтернативной специфичностью и каталитической эффективностью по отношению к процессингу внутриклеточных белков. Скорее всего, это «переключение» имеет непосредственное отношению к различной презентации антигенов в норме и патологии. Паттерн деградации ОБМ иммунопротеасомой до настоящего времени изучен не был.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Протеасома была выделена и очищена по методу, описанному в . Сначала была исследована деградация ОБМ (изоформа с молекулярной массой 18.5 кДа из мозга быка) полным 26S комплексом и каталитической 20S субъединицей, выделенными из печени аутбредных мышей. Как показано на рис. 1, инкубация ОБМ как с 20S, так и с 26S протеасомой приводила к постепенной деградации ОБМ. Уже через 45 мин 20S протеасома полностью гидролизовала основной белок миелина, в то время как 26S протеасо-ме на это требовалось 85 мин. Такое различие в скоростях можно отнести к разному количеству протеасомы: в случае 20S протеасомы соотношение фермент/субстрат составило 2.7/1 (по белку, мкг/мкг) или 1/14.5 (моль/моль), а в случае 26S соотношение фермент/субстрат составило 1/1 (по белку, мкг/мкг) или 1/110 (моль/моль). Количество протеасомы оценивали по методу Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Гидролизаты ОБМ, полученные под действием 20S и 26S комплексов из печени аутбредных мышей, были разделены на фракции методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке С4 (Waters, DeltaPak, 300 А). Наблюдаются некоторые отличия в профилях элюции, в частности, в некоторых пиках, совпадающих для 20S и 26S протеасом, содержится разное количество вещества, кроме того, при гидролизе 26S протеасомой появляются новые фракции. Таким образом,

паттерн деградации ОБМ 26S протеасомой несколько изменен по сравнению с таковым для 20S протеасомы. Отмеченные различия можно объяснить разной доступностью для протеолиза участков ОБМ, находящихся на поверхности белковой глобулы и в глубине молекулы, а также имеющих выраженную вторичную структуру. Для 26S протеасомы доступность разных участков ОБМ не имеет большого значения, поскольку в составе 19S субчастицы есть субъединицы, отвечающие за денатурацию молекул белка, которые будут подвергнуты деградации.

Пул протеасом неоднороден и состоит из макромоле-кулярных комплексов нескольких типов, причем каталитические субъединицы могут относиться к т. н. конститутивным (ßl, ß2 и ß5) или иммунным (ßli, ß2i и ß5i) (рис. 2). Шесть каталитических субъединиц протеасомы обладают тремя типами активности, а именно: химотрипсино-подобной (гидролиз после гидрофобных и ароматических аминокислот Leu, Tyr, Phe), трипсиноподобной (гидролиз после положительно заряженных Lys и Arg) и каспазо-подобной (гидролиз после отрицательно заряженных Asp и Glu) .

Соотношение конститутивная протеасома/иммунопро-теасома имеет ярко выраженную тканеспецифичность и в значительной степени зависит от иммунного статуса организма. Так, например, в головном мозге в норме более 90 % протеасом - конститутивные, а в селезенке около 9095 % протеасом являются иммунопротеасомами. Кроме того, в любых тканях под действием гамма-интерферона интенсивно нарабатываются иммуносубъединицы, которые встраиваются во вновь собранные мультикаталити-ческие комплексы . Ранее было показано, что замены каталитических субъединиц на иммунные приводят к изменению специфичности гидролиза и увеличению его скорости. Иммунопротеасома практически теряет способность

sm ■ . з1 »I Ri-

Конститутивная ^ ■Шф Иммуно

"шШЖМ TSf"fA qgjMSb-""

Рис. 2. Равновесие протеасома - иммунопротеасома. Иммунные каталитические субъединицы нарабатываются под действием гамма-интерферона

Рис. 3. Аминокислотная последовательность ОБМ. Стрелками указаны протео-литические пептиды, определенные с помощью хромато-масс-спектрометрии в гидролизатах ОБМ протеасомой из мозга мышей линии SJL/J (верхняя часть рисунка) и Ва1Ь/С (нижняя часть рисунка). Толщина стрелок обозначает частоту встречаемости соответствующего пептида. Цветными прямоугольниками выделены иммунодоминантные районы ОБМ

Рис. 4. Распределение по длинам пептидов, обнаруженных в гидролизатах ОБМ пулами протеасом из мозга мышей линии

б) SJL/J. Столбиками на диаграмме представлены экспериментальные значения ионного тока для пептидов данной длины, полученные методом LC-MS масс-спектрометрии

гидролизовать пептидные связи после остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот (каспазоподобная активность), зато значительно чаще происходит гидролиз после гидрофобных и особенно разветвленных гидрофобных аминокислотных остатков. Таким образом, под действием иммунопротеасомы получается большее количество пептидов, несущих гидрофобные аминокислоты на С-конце. Поскольку С-концевые гидрофобные аминокислоты являются важными якорными фрагментами для связывания с молекулами I класса главного комплекса гистосовместимости, следовательно, изменение в специфичности гидролиза приводит к увеличению выработки пептидов, образующих комплексы с молекулами MHC. Фрагменты, связанные с молекулами МНС, презентируются на внешней мембране клеткам иммунной системы. Таким образом, клетки, содержащие иммунопротеасому, будут более эффективно презентировать свои антигены.

Кроме того, известно, что альфа-субъединицы каталитической 20S субчастицы протеасомы действуют как ворота, формируя аксиальный канал, регулирующий вход и выход белков и продуктов их деградации. Закрытие канала может, таким образом, способствовать более полной деградации субстратов, поскольку препятствует выходу

частично гидролизованных полипептидов . Было также продемонстрировано , что открывание канала сильно влияет на кинетику протеолиза и распределение по длине гидролитических фрагментов, полученных in vitro. Если канал открыт, то скорость гидролиза увеличивается, но при этом средняя длина получающихся фрагментов также увеличивается на 40 %. Таким образом, более высокая скорость работы иммунопротеасомы должна приводить к более длинным пептидам - продуктам деградации, которые будут лучше связываться с молекулами МНС и, следовательно, более эффективно представляться на поверхности клетки.

Известно, что мыши линии SJL генетически предрасположены к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. Данная патология является животной моделью рассеянного склероза. С помощью иммуноблоттинга мы изучили состав пула протеасом в головном мозге мышей этой линии и показали, что содержание иммунопротеасом повышено по сравнению с мышами линии Balb/C (данные не приведены). Поэтому на следующем этапе из мозга мышей линии Balb/C и линии SJL была выделена 26S протеасома и изучен протеолиз ОБМ этими образцами протеасом.

Гидролизаты ОБМ, полученные под действием протеасом,

выделенных из мозга мышей этих двух линий, были исследованы методом LC-MS (высокоэффективная жидкостная хроматография с детекцией методом масс-спектрометрии). На рис. 3 приведена последовательность основного белка миелина с указанием мажорных фрагментов, продуцируемых пулами протеасом из разных источников. Толщина соответствующих стрелок демонстрирует относительное количество пептида в гидролизате при анализе.

В аминокислотной последовательности ОБМ выделяют следующие области, соответствующие иммунодоминант-ным районам белка: 12-31, 82-98, 110-128 и 144-169, причем фрагмент 85-98 представляет собой т.н. энцефалитогенный эпитоп.

Необходимо отметить, что деградация ОБМ протеасо-мой из печени аутбредных мышей, как полным комплексом, так и каталитической частью, не приводила к выщеплению иммуногенных пептидов, все они подвергались дальнейшей фрагментации внутри каталитической камеры протеасомы.

В гидролизате ОБМ протеасомой из мозга мышей обеих линий практически единственным сайтом гидролиза, где протеасома проявляла свою каспазоподобную активность, была связь между аминокислотными остатками Asp81-Glu82, близкая к началу энцефалитогенного пептида.

Характер гидролиза ОБМ протеасомами, выделенными из головного мозга мышей линии SJL и Balb/C, был различен. У мышей аутоиммунной линии генерируемые эпитопы существенно лучше колокализуются с иммунодоминантны-ми фрагментами белка. При действии данного пула на ОБМ содержание фрагмента энцефалитогенного пептида составляет до четверти всех получаемых фрагментов гидролиза. У мышей стандартной линии Balb/C - в два раза меньше. Кроме того, полученные фрагменты существенно хуже соотносятся с областями узнавания комплексов гистосовместимости второго класса.

На рис. 4 представлено распределение по длинам пептидов в соответствующих гидролизатах. По оси ординат представлены экспериментальные значения ионного тока для пептидов данной длины, полученные методом LC-MS. Из рисунка видно, что максимум распределения приходится на пептиды длиной 8 аминокислот в случае протеасом из головного мозга мышей как линии SJL, так и Balb/C. Однако относительное значение среднего ионного тока в мак-

симуме сильно различается, что свидетельствует о существенно большем количестве фрагментов данной длины в случае мышей аутоиммунной линии. В гидролизатах превалируют пептиды с четным числом аминокислотных остатков, ни в одном из них не было обнаружено пептидов короче четырех аминокислотных остатков. Эти данные согласуются с описанными в литературе , а также с тем, что одной из главных ролей протеасомы в клетке является генерация пептидов для последующей презентации на молекулах МНС I класса, на которые могут загружаться пептиды длиной до 10 аминокислотных остатков. Присутствующие в гидролизатах более длинные пептиды могут затем расщепляться до фрагментов меньшей длины и представляться на молекулах МНС I класса, а также участвовать в презентации на молекулах МНС II класса .

Таким образом, в настоящей работе показано, что 20S и 26S протеасомы способны гидролизовать основной белок миелина, при этом молярное соотношение протеасома/ОБМ составило 1 /14.5 для 20S и 1/110 для 26S, время полного гидролиза 45 мин и 85 мин соответственно. После разделения гидролизатов методом LC-MS массы фрагментов были определены методом MALDI-масс-спектрометрии, и, после анализа аминокислотной последовательности ОБМ, идентифицированы сайты протеолиза.

Нами было продемонстрировано, что основной белок миелина (не подвергавшийся убиквитинилированию) является хорошим субстратом как для 20S, так и для 26S протеасомы. Впервые были определены сайты протеоли-за ОБМ протеасомой из мозга мышей линий Balb/C и SJL и показаны значительные различия в паттерне деградации данного нейроантигена, что может свидетельствовать о лучшей презентации фрагментов основного белка миелина на комплексах гистосовместимости в случае мышей, предрасположенных к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита.

Работа была поддержана грантами РФФИ 07-04-12100-офи, 09-04-01546-а, 07-04-92168-НЦНИ_а,

NATO SFPP 982833 и программой президиума РАН фундаментальные науки - медицине 2008 г.

Список литературы

1. Ponomarenko, N.A., Durova, O.M., Vorobiev, I.I., Aleksandrova, E.A., Telegin, G.B., Chamborant, O.A., Sidorik, L.L., Suchkov, S.V., Alekberova, Z.S., Gnuchev, N.V., Gabibov, A.G. // J. Immunol. Methods, 2002. V. 269, P. 197- 211.

2. Ponomarenko, N. A., Durova, O. M., Vorobiev, I. I., Belogurov, A. A., Telegin, G. B., Suchkov, S. V., Kiselev, S. L., Lagarkova, M. A., Govorun, V. M., Serebryakova, M. V., Gabibov, A.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006. V. 103, P. 281-286.

3. Belogurov, A.A. Jr., Kurkova, I.N., Friboulet, A., Thomas, D., Misikov, V.K., Zakharova, M.Y., Suchkov, S.V., Kotov, S.V., Alehin, A.I., Avalle, B., Souslova, E.A., Morse, H.C. 3rd., Gabibov, A.G., Ponomarenko, N.A. // J. Immunol., 2008. V. 180, P. 1258-1267.

4. Polosukhina, D. I., Kanyshkova, T. G., Doronin, B. M., Tyshkevich, O. B., Buneva, V. N.. Boiko, A. N., Gusev E. I., Nevinsky, G. A., Favorova, O. O. // Immunol Lett., 2006. V. 103, P. 75-81.

5. Белогуров, А. А., Куркова, И. Н., Мисиков, В. К., Сучков, С. В., Телегин, Г. Б., Алехин, А. И., Гончаров, Н. Г., Кнорре, В. Д., Габибов, А. Г., Пономаренко, Н. А. // Доклады Академии Наук, 2007. Т. 413, С. 408-411.

6. Pritzker, L. B., Joshi, S., Gowan, J. J., Harauz, G., Moscarello, M. A., // Biochemistry,

2000. V. 39, P. 5374-5381.

7. Schaecher, K. E., Shields, D. C., Banik. N. L. // Neurochemical Research, 2001. V. 26, P 731-737.

8. Medveczky, P., Antal, J., Patthy, A., Kekesi, K., Juhasz, G., Szilagyi, L., Graf, L. // FEBS Lett, 2006. V. 580, P 545-552.

9. D"Souza, C. A., Moscarello, M. A. // Neurochem Res, 2006. V. 31, P 1045-1054.

10. Tewari, M. K., Sinnthamby, G., Rajagopal, D., Eiseinlohr L. C., // Nature Imm, 2005. V.

6, N. 3, P 287-294.

11. Lucas, J., Lobo, D., Terry, E., Hogan, E. L., Banik N. L. // Neurochem. Res., 1992. V. 17,

12. Akaishi, T., Shiomi, T., Sawada, H., Yokosawa, H. // Brain Research, 1996. V. 722, P 139-144

13. Абрамова, Е. Б., Астахова, Т. М., Ерохов, П. А., Шарова, Н. П. // Известия РАН, серия биологическая, 2004. Т. 2, С. 150-156.

14. Orlowski, M., Cardozo, C., Michaud, C. // Biochemistry, 1993. V. 32, P 1563-1572.

15. Namiki, S., Nakamura, T., Oshima, S., Yamazaki, M., Sekine, Y., Tsuchiya, K., Okamoto, R., Kanai, T., Watanabe, M. // FEBS Lett, 2005. V. 579, P. 2781-2787.

16. Kisselev, A. F., Kaganovich, D., Goldberg, A. L. // J. Biol. Chem., 2002. V. 277, P. 22260-22270.

17. Kohler, A., Cascio, P., Leggett, D. S., Woo, K. M., Goldberg, A. L., Finley, D. // Mol. Cell.,

2001. V. 7, P. 1143-1152.

18. Mishto, M., Luciani, F., Holzhutter, H.G., Bellavista, E., Santoro, A., Textoris-Taube, K., Franceschi, C., Kloetzel, PM., Zaikin, A. // J. Biol. Chem., 2008. V. 377, P. 1607-1617.

Все липиды, обнаруженные в мозге крысы, присутствуют и в миелине, т. е. нет липидов, локализованных исключительно в немиелиновых структурах (за исключением специфического митохондриального липида дифосфатидилглицерола). Верно и обратное - нет таких липидов миелина, которые не были бы обнаружены в других субклеточных фракциях мозга.

Цереброзид - наиболее типичный компонент миелина. За исключением самого раннего периода развития организма, концентрация цереброзида в мозге прямо пропорциональна количеству в нем миелина. Только 1/5 общего содержания галактолипидов в миелине встречается в сульфатированной форме. Цереброзиды и сульфатиды играют важную роль в обеспечении стабильности миелина.

Для миелина также характерен высокий уровень его главных липидов - холестерина, общих галактолипидов и содержащего этаноламин плазмалогена. Установлено, что до 70% холестерина мозга находится в миелине. Поскольку почти половина белого вещества мозга может состоять из миелина, очевидно, что в мозге содержится наибольшее количество холестерина по сравнению с другими органами. Высокая концентрация холестерина в мозге, особенно в миелине, определяется основной функцией нейрональной ткани - генерировать и проводить нервные импульсы. Большое содержание холестерина в миелине и своеобразие его структуры приводят к уменьшению ионной утечки через мембрану нейрона (вследствие ее высокого сопротивления).

Фосфатидилхолин также является существенной составной частью миелина, хотя сфингомиелин содержится в относительно незначительном количестве.

Липидный состав как серого вещества, так и белого вещества мозга отчетливо отличается от такового у миелина. Состав миелина мозга всех изученных видов млекопитающих почти одинаков; имеют место лишь незначительные различия (например, миелин крысы имеет меньше сфингомиелина, чем миелин быка или человека). Существуют некоторые вариации и в зависимости от локализации миелина, например миелин, изолированный из спинного мозга, имеет более высокое значение отношения липида к белку, чем миелин из головного мозга.

В состав миелина входят также полифосфатидилинозиты, из которых трифосфоинозитид составляет от 4 до 6% общего фосфора миелина, а дифосфоинозитид- от 1 до 1,5%. Минорные компоненты миелина включают по крайней мере три эфира цереброзида и два липида на основе глицерина; в составе миелина также присутствуют некоторые длинноцепочечные алканы. Миелин млекопитающих содержит от 0,1 до 0,3% ганглиозидов. В миелине содержится больше моносиалоганглиозида вМ1 по сравнению с тем, что обнаруживается в мембранах мозга. Миелин многих организмов, в том числе и человека, содержит уникальный ганглиозид сиалозилгалактозилцерамид ОМ4.

Липиды миелина ПНС

Липиды миелина периферической и центральной нервной системы качественно подобны, но между ними есть количественные различия. Миелин ПНС содержит меньше цереброзидов и сульфатидов и значительно больше сфингомиелина, чем миелин ЦНС. Интересно отметить наличие ганглиозида ОМр характерного для миелина ПНС некоторых организмов. Различия в составе липидов миелина центральной и периферической нервной системы не столь существенны, как их различия по белковому составу.

Белки миелина ЦНС

Белковый состав миелина ЦНС более прост, чем других мембран мозга, и представлен главным образом протеолипидами и основными белками, которые составляют 60-80% от общего количества. Гликопротеины присутствуют в гораздо меньших количествах. Миелин центральной нервной системы содержит уникальные белки.

Для миелина ЦНС человека характерно количественное превалирование двух белков: положительно заряженного катионного белка миелина (myelin basic protein, МВР) и протеолипида миелина (myelin proteolipid protein, PLP). Эти белки - главные составные части миелина ЦНС всех млекопитающих.

Миелиновый протеолипид PLP (proteolipid protein), также известный как белок Фолча, имеет способность растворяться в органических растворителях. Молекулярная масса PLP составляет приблизительно 30 кДа (Да - дальтон). Его аминокислотная последовательность чрезвычайно консервативна, молекула формирует несколько доменов. Молекула PLP включает три жирные кислоты, как правило, пальмитиновую, олеиновую и стеариновую, соединенные с аминокислотными радикалами эфирной связью.

Миелин ЦНС содержит несколько меньшие количества другого протеолипида - DM-20, названного так по его молекулярной массе (20 кДа). И анализ ДНК, и выяснение первичной структуры показали, что DM-20 образуется в результате отщепления 35 аминокислотных остатков от белка PLP. В процессе развития DM-20 появляется раньше, чем PLP (в некоторых случаях даже до появления миелина); предполагают, что в дополнение к структурной роли в образовании миелина он может участвовать в дифференцировке олигодендроцитов.

Вопреки представлениям о том, что PLP необходим для формирования компактного мультиламеллярного миелина, процесс образования миелина у мышей, «нокаутированных» по PLP/DM-20, происходит лишь с незначительными отклонениями. Однако у таких мышей уменьшена продолжительность жизни и нарушена общая подвижность. Напротив, естественно происходящие мутации в PLP, в том числе его повышенная экспрессия (normal PLP over-expression), имеют серьезные функциональные последствия. Следует отметить, что существенные количества белков PLP и DM-20 представлены в ЦНС, матричная РНК для PLP есть и в ПНС, и небольшое количество белка там синтезируется, но не включается в миелин.

Катионный белок миелина (МВР) привлекает внимание исследователей вследствие его антигенной природы - при введении животным он вызывает аутоиммунную реакцию, так называемый экспериментальный аллергический энцефаломиелит, который представляет собой модель тяжелого нейродегенеративного заболевания - рассеянного склероза.

Аминокислотная последовательность МВР у многих организмов высоко консервативна. МВР расположен на цитоплазматической стороне миелиновых мембран. Он имеет молекулярную массу 18,5 кДа и лишен признаков третичной структуры. Этот основный белок обнаруживает микрогетерогенность при электрофорезе в щелочных условиях. Большинство исследованных млекопитающих содержали различные количества изоформ МБР, имеющих существенную общую часть аминокислотной последовательности. Молекулярная масса МБР мышей и крыс - 14 кДа. МБР с малой молекулярной массой имеет такие же аминокислотные последовательности на N- и С-терминальных частях молекулы, как и остальной МБР, но отличается редукцией около 40 аминокислотных остатков. Соотношение этих основных белков изменяется в процессе развития: зрелые крысы и мыши имеют больше МБР с молекулярной массой 14кДа, чем МБР с молекулярной массой 18 кДа. Две другие изоформы МБР, также обнаруживаемые во многих организмах, имеют молекулярную массу 21,5 и 17 кДа, соответственно. Они образованы присоединением к основной структуре полипептидной последовательности массой около 3 кДа.

При электрофоретическом разделении белков миелина выявляются белки с более высокой молекулярной массой. Их количество зависит от вида организма. Например, мышь и крыса могут содержать таких белков до 30% от общего количества. Содержание этих белков также изменяется в зависимости от возраста животного: чем оно моложе, тем меньше в его мозге миелина, но тем больше в нем белков с более высокой молекулярной массой.

Фермент 2" 3"-циклический нуклеотид З"-фосфодиэстераза (CNP) составляет несколько процентов от общего содержания миелинового белка в клетках ЦНС. Это гораздо больше, чем в других типах клеток. Белок CNP - не главный компонент компактного миелина, он сконцентрирован лишь в определенных участках миелиновой оболочки, связанной с цитоплазмой олигодендроцита. Белок локализован в цитоплазме, но часть его связана с цитоскелетом мембраны - F-актином и тубулином. Биологическая функция CNP может заключаться в регулировании структуры цитоскелета для ускорения процессов роста и дифференциации в олигодендроцитах.

Миелинассоциированный гликопротеин (MAG) - минорный в количественном отношении компонент очищенного миелина, имеет молекулярную массу 100 кДа, содержится в ЦНС в небольшом количестве (менее 1 % от общего белка). MAG имеет единственный трансмембранный домен, который отделяет сильногликозилированную внеклеточную часть молекулы, составленную из пяти подобных иммуноглобулину доменов, от внутриклеточного домена. Его полная структура подобна белку адгезии нейрональной клетки (NCAM).

MAG не присутствует в компактном, мультиламеллярном миелине, но находится в периаксональных мембранах олигодендроцитов, образующих слои миелина. Напомним, что периаксональная мембрана олигодендроцита - наиболее близко расположена к плазматической мембране аксона, но тем не менее эти две мембраны не сливаются, а разделены экстраклеточной щелью. Подобная особенность локализации MAG, а также то, что этот белок относится к иммуноглобулиновому суперсемейству, подтверждает участие его в процессах адгезии и передачи информации (сигналинга) между аксолеммой и миелинобразующими олигодендроцитами в процессе миелинизации. Кроме того, MAG - один из компонентов белого вещества ЦНС, который ингибирует рост нейритов в культуре ткани.

Из других гликопротеинов белого вещества и миелина следует отметить минорный миелинолигодендроцитарный гликопротеин (Myelin-oligodendrocytic glycoprotein, MOG). MOG является трансмембранным белком, содержащим единственный иммуноглобулинподобный домен. В отличие от MAG, который расположен во внутренних слоях миелина, MOG локализован в его поверхностных слоях, в силу чего может участвовать в передаче внеклеточной информации к олигодендроциту.

Малые количества характерных белков мембран могут быть идентифицированы в результате электрофореза на полиакриламидном геле (ПААГ) (например, тубулин). Электрофорез высокого разрешения демонстрирует наличие других незначительных полос белка; они могут быть связаны с присутствием ряда ферментов миелиновой оболочки.

Белки миелина ПНС

Миелин ПНС содержит как некоторые уникальные белки, так и несколько общих с белками миелина ЦНС белков.

Р0 - главный белок миелина ПНС, имеет молекулярную массу 30 кДа, составляет более половины белков миелина ПНС. Интересно отметить, что хотя он отличается от PLP по аминокислотной последовательности, путям посттрансляционной модификации и структуре, тем не менее оба эти белка имеют одинаково важное значение для формирования структуры миелина ЦНС и ПНС.

Содержание МВР в миелине ПНС составляет 5-18% от общего количества белка, в отличие от ЦНС, где его доля достигает трети всего белка. Те же четыре формы белка МВР с молекулярными массами 21, 18,5, 17 и 14кДа, соответственно, обнаруженные в миелине ЦНС, присутствуют и в ПНС. У взрослых грызунов МВР с молекулярной массой 14 кДа (по классификации периферийных миелиновых белков ему присвоено название «Рr») является самым значительным компонентом всех катионных белков. В миелине ПНС присутствует и МВР с молекулярной массой 18 кДа (в этом случае он носит название «белок Р1»). Следует отметить, что важность семейства белков МВР не так велика для миелиновой структуры ПНС, как для ЦНС.

Гликопротеины миелина ПНС

Компактный миелин ПНС содержит гликопротеин с молекулярной массой 22 кДа, названный периферийным миелиновым белком 22 (РМР-22), доля которого составляет менее 5% от общего содержания белков. РМР-22 имеет четыре трансмембранных домена и один гликозилированный домен. Этот белок не играет значительной структурной роли. Однако аномалии гена рmр-22 ответственны за некоторые наследственные невропатологии человека.

Несколько десятилетий назад считалось, что миелин создает инертную оболочку, которая не выполняет никаких биохимических функций. Однако позже в миелине было обнаружено большое количество ферментов, вовлекаемых в синтез и метаболизм компонентов миелина. Ряд ферментов, присутствующих в миелине, включается в метаболизм фосфоинозитидов: фосфатидилинозитолкиназа, дифосфатидилинозитолкиназа, соответствующие фосфатазы и диглицеридкиназы. Эти ферменты представляют интерес вследствие высокой концентрации в миелине полифосфоинозитидов и их быстрого обмена. Есть свидетельства присутствия в миелине мускариновых холинергических рецепторов, G-белков, фосфолипаз С и Э, протеинкиназы С.

В миелине ПНС обнаружена Nа/К-АТФаза, осуществляющая транспорт одновалентных катионов, а также 6"-нуклеотидаза. Наличие этих ферментов позволяет предположить, что миелин может принимать активное участие в аксональном транспорте.